载脂蛋白M对内皮型一氧化氮合酶表达及磷酸化的影响

来源 :苏州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fanjiao1989
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目的:越来越多的研究表明载脂蛋白M(apoM)作为高密度脂蛋白(HDL)的组成成分及1-磷酸鞘氨醇(S1P)的生理性载体广泛地参与了体内众多的病理生理过程。apoM与内皮保护作用及机体炎症反应密切相关。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)主要存在于内皮细胞中,与内皮细胞的炎症、血管的舒缩以及血小板粘附聚集等生物过程紧密相关。本研究旨在探究apoM是否通过介导eNOS表达水平及其活性的变化参与机体的病理生理过程。方法:(1)用空载慢病毒和携带apoM基因的慢病毒转染人脐静脉细胞与肺腺癌细胞A549的融合细胞株EA.hy926细胞,获得稳定表达的空载慢病毒转染的EA.hy926细胞(apoMTgN)和携带apoM基因的慢病毒转染的EA.hy926细胞(apoMTg),待细胞生长至70%80%的时候,换用1%的BSA继续培养细胞12小时后用浓度为10ng/ml的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分别处理上述细胞12小时,收集细胞并提取细胞总RNA,检测细胞eNOS mRNA的表达水平,比较分析apoM对eNOS表达水平的影响。(2)随机选取选取810周(体重约25g)健康雄性野生型(apoM+/+)及apoM基因敲除型(apoM-/-)的C57BL/6小鼠各16只,将apoM+/+小鼠随机分为生理盐水组和脂多糖(LPS)组,每组8只,apoM-/-小鼠随机分组方法与apoM+/+小鼠分组方法相同,分别腹腔注射生理盐水或者10mg/kg LPS12h后处死小鼠取其肾脏提取RNA,检测eNOS mRNA的表达水平变化。(3)传代培养apoMTgN及apoMTg至适当量后铺六孔板,待细胞生长至70%80%的时候,换用1%的BSA继续培养细胞,24h后收集细胞并提取细胞总蛋白,用westernblot法检测eNOS中Ser1177位点的磷酸化水平及eNOS的总蛋白量,分析比较细胞过表达apoM对细胞中eNOS总量及对eNOS Ser1177位点磷酸化的影响。结果:(1)apoMTg与apoMTgN相比可增强eNOS mRNA的表达水平。TNF-α处理12小时后,与空白对照组及12小时TNF-α处理的apoMTgN细胞相比,apoMTg细胞中eNOS mRNA的表达量明显增加。(2)生理状况下apoM-/-小鼠与apoM+/+小鼠相比体内eNOS的表达水平无明显变化,LPS处理12小时后,apoM+/+小鼠体内的eNOS mRN A表达水平较apo M-/-小鼠明显升高。apoM+/+小鼠在LPS处理前后体内eNOS mRNA表达水平也明显升高。(3)apoMTg组与相应的对照apoMTgN组相比,对内皮细胞中eNOS蛋白表达总量无明显影响但能显著增强eNOS Ser1177位点的磷酸化水平。结论:ApoM在炎症状况下显著上调eNOS mRNA的表达。ApoM可能通过增强eNOS Ser1177的磷酸化进而发挥抗炎的作用。
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