初级纤毛（Primary cilia）属于纤毛的一种,存在于真核细胞表面,体形微小但结构复杂。作为一种高度保守的非运动型细胞器,初级纤毛具有重要的感官作用,能够感知环境中的机械力、化学和生物信号,并协助其传导至细胞内引起细胞应答。纤毛长度约5¹0μm,直径约0.25μm。纤毛由基体（来自中心体的母中心粒）延伸而来,主要由中央轴丝、围绕它的纤毛膜和纤毛基质组成。轴丝是纤毛的骨架结构,由9组环形排列的二联体维管束及其附属蛋白组成。纤毛膜是与细胞膜相连的双层脂质膜,但膜蛋白成分有所不同,它富含特异性信号传导受体和离子通道,使纤毛能够检测到细胞外环境变化并传递细胞外信号,以调节发育过程中的多种细胞过程并维持组织稳态。纤毛基质主要是由用于纤毛组装和周转的可溶性蛋白组成。初级纤毛的发生是一个复杂、有序的过程。当细胞有丝分裂周期结束,进入G0静止期时,初级纤毛的组装开始。母中心粒转变成基体,并招募其附近的由纤毛前期囊泡连续融合形成的纤毛囊泡,进一步延伸为轴丝。母中心体具有由多种蛋白质组成的远端附属物,由远端中心粒蛋白募集;它们对于将母中心粒锚定到纤毛膜是必不可少的,并在基体中演变成过渡纤维。最终囊泡与细胞质膜融合以使纤毛暴露于细胞外环境。蛋白不能在纤毛内合成,因此初级纤毛的自组装、维持和解聚,必须依赖于鞭毛内运输蛋白（intraflagellar transport,IFT）系统来调控纤毛内物质的双向运输。IFT系统进化保守,由两种稳定的复合物（IFT-A和IFT-B）组成,用于将纤毛靶向蛋白连接到负责沿着微管轴丝进行双向转运的马达分子。IFT-A复合物主要负责纤毛内物质的反向运输,由胞质动力蛋白2介导;而IFT-B则负责正向运输,由驱动蛋白家族成员Kinesin 2负责。IFT系统中的任何一个蛋白发生突变都会导致初级纤毛形态改变或缺失。研究表明,初级纤毛在调节细胞内Ca²⁺水平的信号传导途径以及Hedgehog（Hh）信号通路和平面细胞极性（PCP）途径中至关重要。其中,Hedgehog信号通路用于细胞间通讯,在中央神经系统、肢体以及胚胎结构的发育中起着重要的作用,控制着细胞的“命运”和增殖。与其他核心发育的信号通路不同,脊椎动物Hh信号完全依赖于高度专业化的细胞器,即初级纤毛。研究表明,纤毛在Sonic Hedgehog（Shh）信号通路转导过程中起着重要的作用。Hh信号通路的蛋白大部分定位于初级纤毛上,包括七次跨膜蛋白Smoothened（Smo）,12次跨膜蛋白Patched（PTCH1）,转录因子Gli1-3以及负调控因子Sufu。膜受体Ptc位于纤毛的基底,在没有配体Hh的情况下,通过阻止Smo进入纤毛来抑制Hh信号传导。此时全长转录因子Gli3^FL被裂解为抑制因子Gli3^Rep。当与配体Hh结合时,Ptc移出纤毛,Smo被激活并在纤毛积聚,从而使下游的Gli转录因子被修饰而活化,诱导靶基因转录和表达。Hh信号活性的缺失会导致严重的先天畸形,初级纤毛对Hh信号的传导是必不可少的,而Hh信号通路的异常可引起多种肿瘤的发生,这为人们对肿瘤疾病的治疗方法提供了新的思路。将纤毛/基体/中心体蛋白与人类遗传疾病联系起来的研究也表明,受损的纤毛功能可能对细胞稳态产生深远的影响。初级纤毛结构和功能的缺陷与广泛的发育异常和代谢疾病相关,可以影响胚胎发育过程中以及出生后的许多不同器官,包括开放性脑损伤,前脑无裂畸形,多指,小眼症,多囊肾,视网膜变性和肥胖症等,通常被称为“纤毛疾病”。纤毛病变的患者通常并发出现多个症状,例如慢性鼻窦炎和呼吸系统感染,心脏及其他脏器的转位,胸廓畸形,生育能力降低,骨盆发育不良,视觉、听觉和嗅觉的失常,软骨异常,多指（趾）畸形,脑部发育异常,肝肾的多囊性增生等等。因此,深入地探索纤毛调控机理对基础生物学理论的发展和开发治疗人类纤毛疾病的新疗法有重要意义。Rab34是与高尔基体相关的小GTP酶。先前的研究显示,Rab34的缺失导致小鼠多指畸形的异常表型。Rab蛋白是一类调节型的小分子GTP结合蛋白的六大家族之一,通过与GTP/GDP结合来调控其活化状态,是细胞信号传递的重要分子开关。以往的研究表明,Rab蛋白在体外培养的细胞中与纤毛的形成有关,但是在机体内尚未发现。Rab34是Rab家族成员之一,与效应子一起参与细胞内的囊泡运输过程。而最近的一项大型的CRISPR筛选研究报告称Rab34与培养细胞中的纤毛发生和Hh信号传导相关,然而,这项研究中没有提出体内研究和机制。因此,本项研究旨在进一步了解在小鼠体内,Rab34影响小鼠发育的分子及细胞机制。鉴于许多纤毛基因突变由于降低了产生Gli3阻遏物的Gli3加工进程从而影响肢体发育模式,因此我们探讨Rab34参与纤毛发生的可能性。首先,我们设计两种对Rab34特异识别的独立sgRNA,通过Crispr-cas9基因编辑技术,将Rab34相对应的sgRNAs的DNA寡核苷酸克隆至pLenti-Crispr-v2载体。然后,通过包装、转染并收集慢病毒,进一步感染目的细胞系,我们构建了体外培养的Rab34^-/-的稳定细胞系。通过免疫荧光染色技术,我们发现Rab34^-/-细胞系中纤毛的形成明显降低。而为了探索在小鼠体内Rab34的缺失是否影响纤毛的形成,我们采用基因打靶的技术构建了Rab34基因敲除小鼠。将嵌合鼠与野生型C57BL/6J小鼠杂交,获得第一代（F1）杂合子小鼠。F1代杂合子小鼠相互杂交后,收集不同胚胎期的Rab34基因突变纯合子胚胎,并观察其遗传表型。统计小鼠胚胎基因型,结果显示约25%的E18.5胚胎是纯合的,并且都是活的;然而没有新生纯合子小鼠活着,这表明Rab34突变小鼠在出生时死亡。通过观察小鼠胚胎,发现Rab34^-/-小鼠胚胎表现出多指、唇裂和颚裂的异常特征。为了判断Rab34突变小鼠中的纤毛发生是否受到影响,我们收集E10.5 Rab34突变小鼠及野生型小鼠胚胎,并制备冷冻组织切片。利用免疫荧光染色的方法,检测突变纯合子胚胎神经管及肢芽的纤毛形成是否正常。我们发现在Rab34突变体中,纤毛的数量明显降低。这表明在小鼠体内,Rab34的缺失影响纤毛的形成。另外,通过免疫荧光染色的方法,我们检测Rab34基因对Rab8、Rab11、Rabin8、BBS4、Ehd1、IFT20、Cp110等中心粒和纤毛蛋白的影响。与野生型细胞相比,Rab34基因缺失细胞中的此类蛋白的位置及表达量没有明显变化,这表明以上纤毛形成相关蛋白独立于Rab34。同时,为了确定Rab34的亚细胞定位,需构建过表达Rab34的稳定细胞系。我们首先以小鼠cDNA文库为模板,构建LAP-Rab34WT融合蛋白（GFP和S标签的Rab34WT）,以及LAP-Rab34的两个突变体LAP-Rab34-T66N（抑制状态）和LAP-Rab34-Q111L（激活状态）。并利用GFP和乙酰化微管蛋白（Ac-Tub）共免疫染色,检测Rab34及其突变体的表达情况。结果发现内吞循环蛋白Rab34基因定位于细胞纤毛中Rab34-Q111L活性形式也定位于纤毛,而Rab34-T66N并非如此。通过在NIH3T3细胞中过表达Rab34蛋白,我们发现它既不促进也不抑制NIH3T3细胞的纤毛发生。为了更好地了解Rab34突变小鼠胚胎多指表型形成的分子机制,我们利用蛋白免疫印迹技术（Western blot）检测小鼠胚胎Gli2和Gli3蛋白的表达情况,结果显示Rab34突变胚胎中Gli3加工过程中的阻遏物Gli3^Rep含量降低,而Gli2^FL和Gli3^FL含量明显增高。除此之外,由RT-qPCR检测WT和Rab34突变胚胎细胞被SAG激活剂激活前后的Patch1和Gli1的RNA水平。在SAG激活后,WT细胞Patch1和Gli1的RNA水平为原来的6¹3倍,而在Rab34突变胚胎细胞中并无此现象。这一结果表明Rab34缺失细胞中,Hh信号受损。因此,Rab34是机体内纤毛囊泡形成早期和Hh信号传导所必需的一类蛋白质。通过透射电子显微镜（TEM）观察E10.5 WT和Rab34^-/-胚胎前肢区域附近的神经管中神经上皮细胞中的纤毛,我们发现在Rab34^-/-胚胎中,存在明显的纤毛囊泡积聚的现象。此外,与野生型相比,Rab34突变体锚定在质膜上并被囊泡包围的基体更少（1.2%比11.3%）。因此,Rab34是从纤毛前期的囊泡到形成纤毛囊泡的连续融合,以及母体中心粒从核周区域迁移到细胞质膜所必需的蛋白。综上所述,本研究首次揭示了在小鼠体内,Rab34基因在纤毛形成的过程中具有重要作用,它主要参与纤毛囊泡早期形成的过程;Rab34突变影响了Gli3蛋白的加工和Gli2蛋白的功能,从而抑制Hedgehog信号通路的传导。而基因敲除技术为本文中纤毛发生的调控机制及基因相关表型的研究提供了有力的技术支持。该项研究为初级纤毛相关疾病的干预和治疗奠定了基础。