NK细胞与巨噬细胞在移植慢性排斥反应中的作用机制探讨

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移植慢性排斥反应是导致长期移植患者最终器官衰竭的主要原因。在早期研究中,适应性免疫细胞被认为是参与慢性排斥反应的主要细胞类型。随着免疫抑制剂的出现,适应性免疫细胞在移植反应中得到一定程度的抑制,使移植后患者的存活率有了很大的提高,但移植器官的长期存活率仍然很低。因此,固有免疫细胞在慢性排斥反应中的作用逐渐受到重视。近些年动物实验和临床资料显示,固有免疫细胞特别是自然杀伤细胞(NK细胞)和巨噬细胞在移植慢性排斥反应中起重要作用。但其中的作用机制,尤其是当T、B细胞功能完全缺失条件下NK细胞与巨噬细胞在移植慢性排斥反应中是独自发挥作用还是通过相互调控来降低慢性排斥反应的发生,尚有待明确。目的:通过亲代供体向子一代小鼠皮肤移植探讨建立排斥反应模型,用流式细胞术(FCM)检测皮肤移植术后不同时间点小鼠脾脏及淋巴结NK细胞及巨噬细胞等的比例,结合免疫组化检测移植皮肤NK细胞及巨噬细胞的浸润情况,了解NK细胞及巨噬细胞在小鼠移植术后不同时间点的变化规律及其在慢性排斥反应中的作用。以免疫缺陷小鼠为受者建立异品系心脏移植慢性排斥反应模型并结合体外实验,进一步探讨NK细胞与巨噬细胞在小鼠慢性排斥反应中的作用与关联机制。研究方法:1、NK细胞及巨噬细胞在小鼠移植术后不同时间点的变化规律探索。取C57BL/6小鼠的尾部皮肤移植到F1(C57BL/6×BALB/c)小鼠背部;在术后不同时间点(D1、D2、D3、D5、D7、D10、D14及已发生排斥时)取材(脾脏、淋巴结、外周血及移植皮肤组织),FCM检测术后不同时间点脾脏及淋巴结CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞及巨噬细胞比例;苏木素-伊红(HE)染色检测各时间点移植小鼠皮肤淋巴细胞浸润情况;免疫组化检测小鼠移植皮肤NK细胞及巨噬细胞的浸润情况。2、NK细胞与巨噬细胞在小鼠慢性排斥反应中的作用与关联机制探索。取C57BL/6小鼠心脏作为供体移植物冷缺血处理4小时,NOD/SCID小鼠和CB17/SCID小鼠作为受体进行心脏移植;在心脏移植术后60天内提取脾脏及移植心脏;FCM检测脾脏T细胞、B细胞、NK细胞及巨噬细胞比例及NK细胞和巨噬细胞亚群表达水平;HE染色观察小鼠移植心脏的病理学变化;免疫组化检测移植心脏NK细胞、巨噬细胞的浸润及IL-6的表达水平;提取NK细胞及巨噬细胞体外培养,FCM检测NK细胞活化受体(CD69、NKp46和NKG2D)及抑制性受体Ly49A的表达水平并采用ELISA方法检测上清IL-6和IFN-γ含量。3、由于在课题进展过程中发现实验所用NOD/SCID小鼠与CB17/SCID小鼠意外表现出了极为相似的排斥反应,我们对两种小鼠的NK细胞活性进行了详细评估。采用6-8周NOD/SCID、CB17/SCID和BALB/c小鼠,FCM检测脾脏CD3、CD19、NK1.1和DX5比例;FCM法检测来自于上述品系的正常小鼠脾脏NK细胞功能相关分子表达水平;提取poly(I:C)处理的CB17/SCID小鼠和NOD/SCID小鼠脾细胞和纯化的脾脏NK细胞,经过细胞因子(IL-2,IL-12,IL-15)刺激后与CFSE标记的YAC-1混合培养,通过FCM法进行细胞杀伤活性及NK细胞功能相关分子;细胞因子(IL-2,IL-12,IL-15)体外刺激来自正常小鼠和poly(I:C)处理的小鼠脾细胞,FCM或ELISA方法测定IFN-γ含量。结果:1、NK细胞及巨噬细胞在小鼠移植术后不同时间点的变化规律探索。FCM检测皮肤移植术后不同时间点移植小鼠脾脏及淋巴结CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞及巨噬细胞比例结果显示:异品系移植组(C57BL/6到F1)与同品系移植组(F1到F1)相比,在小鼠脾脏和淋巴结中,各免疫细胞比例随着移植术后时间的延长,无规律性差异变化,提示在本实验条件下的移植术后,亲子代皮肤移植不能够引起脾脏与淋巴结各免疫细胞的规律性差异变化。皮肤移植术后第30-40天有3只小鼠发生慢性排斥反应,脾脏、淋巴结及外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞及巨噬细胞的FCM分析结果显示,其与未发生慢性排斥反应的小鼠相比,各免疫细胞比例无统计学差异;移植皮肤HE染色结果显示,在移植后的第1-5天,同品系移植小鼠及异品系移植小鼠移植皮肤中均有大量的淋巴细胞浸润,未见明显差异。而在第7-14天时,相对于同品系移植小鼠,异品系移植小鼠移植皮肤中仍有大量的淋巴细胞浸润,但这种现象只存在于个别移植小鼠中。免疫组化显示,与非排斥组相比,排斥皮肤存在大量NK细胞及巨噬细胞浸润,且有显著性差异,提示存在NK细胞和巨噬细胞共同参与慢性排斥反应的可能。2、NK细胞与巨噬细胞在小鼠慢性排斥反应中的作用与关联机制探索。小鼠心脏腹腔异位移植术后60天内取材,FCM检测移植小鼠脾脏T细胞和B细胞结果显示移植受体小鼠NOD/SCID和CB17/SCID为T细胞和B细胞缺陷小鼠,不存在“leaky”现象;HE染色显示,两异品系移植组(C57BL/6到CB17/SCID和C57BL/6到NOD/SCID)与同品系移植组(CB17/SCID到CB17/SCID)相比,移植心脏动脉血管壁均出现增厚现象;FCM检测移植小鼠脾脏NK细胞和巨噬细胞及亚群的表达水平,结果显示:两异品系移植组与同品系移植组小鼠相比,三组间无统计学差异;免疫组化结果显示,与同品系移植组相比异品系移植组小鼠移植心脏有大量的NK细胞及巨噬细胞浸润,同时IL-6表达增高,提示NK细胞、巨噬细胞及IL-6很有可能共同参与慢性排斥反应的发生;NK细胞及巨噬细胞体外培养结果显示:相对于NK细胞单独培养组,异品系(C57BL/6小鼠NK细胞与BALB/c小鼠巨噬细胞)混合培养组NK细胞NKp46、NKG2D及Ly49A的表达无差异性,但CD69的表达显著增高;上清中,IL-6及IFN-γ在混合培养组中的含量均显著高于NK细胞及巨噬细胞单独培养时各细胞因子含量之和。3、NOD/SCID小鼠与CB17/SCID小鼠NK细胞活性评估。NK1.1和DX5同时标记C57BL/6、BALB/c、NOD/SCID和CB17/SCID小鼠的脾细胞,FCM分析结果显示:除C57BL/6小鼠外,其他三种品系小鼠脾细胞均不存在NK1.1阳性细胞群;对比检测BALB/c、NOD/SCID和CB17/SCID小鼠脾脏T细胞、B细胞及NK细胞比例,FCM分析结果显示:NOD/SCID和CB17/SCID小鼠脾脏几乎不含有T细胞及B细胞,且NOD/SCID和CB17/SCID小鼠脾脏NK细胞比例无统计学差异;正常小鼠脾脏NK细胞功能相关分子检测结果显示,小鼠脾脏NK细胞CD69、Fas L、TRAIL、granzyme B、perforin和NKp46的表达在三种不同品系小鼠间无差异,但CB17/SCID小鼠脾脏NK细胞NKG2D的表达显著低于BALB/c小鼠和NOD/SCID小鼠,CB17/SCID和BALB/c小鼠脾脏NK细胞NKG2A/C/E的表达显著高于NOD/SCID小鼠,而NOD/SCID小鼠脾脏NK细胞Ly49A的表达显著高于CB17/SCID和BALB/c小鼠。Poly(I:C)处理的NOD/SCID和CB17/SCID小鼠的脾细胞或纯化的NK细胞再经过细胞因子(IL-2,IL-12,IL-15)刺激后的杀伤实验结果显示:CB17/SCID小鼠脾细胞杀伤活性高于NOD/SCID小鼠,而纯化的NK细胞杀伤活性在所有较高效靶比下,除最低效靶比外,两种品系小鼠间无统计学差异;同样激活条件下,NK细胞功能相关分子检测结果显示,两种品系小鼠脾脏NK细胞的perforin和NKp46表达相近,但NOD/SCID小鼠脾脏NK细胞的granzyme B和NKG2A/C/E表达低于CB17/SCID小鼠,而NOD/SCID小鼠NK细胞的NKG2D和Ly49A表达高于CB17/SCID小鼠;小鼠脾细胞经细胞因子体外刺激后,CB17/SCID小鼠脾细胞的IFN-γ表达高于NOD/SCID小鼠,而脾脏NK细胞中IFN-γ的表达在两品系小鼠中无统计学差异。结论:1、异品系亲代到子一代之间的皮肤移植中的NK细胞通常不足以被存在的“missing self”现象激活并导致移植物损伤的慢性排斥;个别出现慢性排斥反应与NK细胞和巨噬细胞有关。2、T、B细胞缺失时异品系小鼠心脏移植受者脾脏、淋巴结及外周血NK细胞与巨噬细胞百分含量不足以反映慢性排斥过程中可能存在的激活状态差异;NK细胞与巨噬细胞作为主要免疫细胞可以在慢性排斥反应中发挥协同作用,而IL-6可能是两者协同促进慢性排斥反应的重要媒介之一。3、与CB17/SCID小鼠和BALB/c小鼠相比,NOD/SCID小鼠的NK细胞的功能仅部分程度削弱,因此并不适合选择NOD/SCID小鼠作为NK细胞缺陷模型。
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