论文部分内容阅读
背景:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）自从 200 年前首次被James Parkinson描述以来,已经成为了神经退行性运动障碍疾病的首要原因。PD患者的典型运动症状包括运动迟缓,静止性震颤,肢体僵硬,和姿势不稳,同时可伴有嗅觉障碍,睡眠障碍,焦虑,抑郁,和便秘等非运动症状。PD患者的病理学表现是黑质致密部多巴胺（Dopamine,DA）能神经元丢失,同时伴有存活的神经元中α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）阳性聚集物Lewybodys（LBs）的形成。尽管大部分PD患者为散发性,但是约5-10%的PD患者表现为家族遗传性。目前认为,PD的发病是由基因因素,环境因素和老龄化交互作用的结果,但其具体发病机制尚不明确。RAB（Ras Analog in Brain,or Ras associated binding）GTPase是Small GTPase家族最大的分支,目前一经报道约70个人类相关的RAB GTPase蛋白。RAB蛋白以“分子开关”机制,在不同的时间和空间上调节细胞内囊泡的运输过程,包括囊泡出芽,锚定,结合,以及囊泡在细胞内沿着细胞骨架的运输。最近研究表明,RAB39B基因突变可以导致X连锁PD,同时可伴有神经发育迟缓,智力障碍,自闭症,癫痫等症状。目前研究提示RAB39B基因高度表达在脑组织内,特别是大脑皮层,海马,纹状体和黑质的神经元内,主要定位于内质网和高尔基体,参与分泌蛋白在内质网-高尔基体之间的早期的运输过程。功能研究提示,RAB39B蛋白参与神经元内α-syn稳态,突触发育,神经递质受体的运输,和自噬等过程。然而,目前RAB39B蛋白在神经元内的定位,潜在的相互作用蛋白,突变后蛋白功能的改变的研究还非常局限。另外,虽然有Rab39b敲除（Knockout,KO）小鼠模型的研究,但其年龄较小,而且主要研究智力障碍,自闭症等RAB39B相关的的精神症状相关表型,尚没有Rab39b-KO小鼠PD相关的行为学,病理学和相关功能研究。目的:探讨RAB39B蛋白在神经元内的定位,不同类型的突变对RAB39B蛋白的功能影响。探讨RAB39B蛋白在活细胞内潜在的相互作用蛋白。同时进一步构建Rab39b-KO小鼠,通过行为学,病理学,以及功能研究,探讨RAB39B基因突变导致PD发病可能机制。方法:1.通过免疫荧光细胞化学染色技术和激光共聚焦显微镜技术,同时诱导小鼠神经母细胞瘤细胞（Neuro-2a）分化为神经元样细胞,研究RAB39B蛋白在神经元的定位;构建携带不同RAB39B突变类型的的质粒,研究RAB39B基因不同类型的突变对RAB39B蛋白表达量和蛋白定位的影响。2.构建稳定表达生物素连接酶和RAB39B蛋白融合蛋白的Neuro-2a细胞系,进一步采用临近标记蛋白组学技术（BioID）研究RAB39B蛋白在活细胞内的临近蛋白,探索其潜在的相互作用蛋白和潜在的细胞功能。3.通过CRISPR/Cas9技术构建Rab39b-KO小鼠模型,通过矿场实验,平衡木实验,转轮实验,步态分析实验等评估小鼠的行为学改变。通过免疫组化染色观察小鼠酪氨酸羟化酶（TH）阳性DA能神经元的形态和数量变化,神经小胶质细胞的激活,神经元是否出现P62阳性的聚集体,以及通过Golgi-Cox染色观察神经元树突棘数目的变化,探讨Rab39b-KO小鼠是否会出现相关病理学改变。进一步通过Western Blot技术探索Rab39b-KO小鼠纹状体和海马组织中囊泡运输相关蛋白,神经递质受体的变化,探讨RAB39B基因突变导致的潜在的下游通路变化。结果:1.RAB39B蛋白在神经元内和内质网,高尔基体,内体有部分共定位关系。大部分RAB39B蛋白分布在神经元的神经突部位。RAB39B基因不同类型的突变可能对功能产生不同的影响:蛋白结构异常或氨基酸电荷的改变参与RAB39B p.T168K突变蛋白的降解;RAB39Bp.G192R突变蛋白在细胞浆内弥散分布,导致细胞囊泡的形成障碍和神经元神经突的发育障碍。2.通过BioID技术能检测到RAB39B蛋白在细胞中的潜在相互蛋白或临近蛋白,生物信息学分析提示RAB39B蛋白参与囊泡运输过程。3.通过CRISPR/Cas9技术成功构建了Rab39b-KO小鼠模型。Rab39b-KO小鼠随着年龄的增长出现了运动症状,以及病理学改变:DA能神经元轴突形态呈串珠样改变;神经小胶质细胞激活;神经元内形成P62阳性聚集物;神经元树突棘数目减少。4.Rab39b-KO小鼠囊泡转运蛋白表达异常:高尔基-内体转运相关蛋白AP1B1表达增高;循环内体运输相关蛋白Rab11表达下调。Rab39b-KO小鼠GABA转运体SLC6A11表达下调。结论:1.RAB39B蛋白主要定位于神经元神经突部位,不同类型的RAB39B突变对RAB39B蛋白的表达和定位产生不同的影响。2.RAB39B蛋白参与细胞内的囊泡运输过程。3.Rab39b-KO小鼠随着年龄增长,表现出PD相关的行为学和病理改变。4.Rab39b-KO小鼠囊泡转运蛋白（AP1B1,Rab11）以及神经递质转运体（SLC6A11）表达失调。