老鸦瓣Tulipa edulis(Miq.)Baker为百合科(Liliaceae)郁金香属(Tulipa L.)药用植物,其去绒毛干燥鳞茎为中药材光慈姑。光慈姑味甘、性寒,有小毒,有消肿、散结、化痰的功效。多用于治疗痢疾、小儿痰厥,痛风等,外治疔疮疖肿、痄腮、丹毒、咽喉肿痛、蛇虫狂犬伤等,目前也是治疗多种肿瘤的常用药,如咽喉癌、淋巴瘤、乳腺癌等。老鸦瓣的芽茎不仅是重要的繁殖体,对老鸦瓣的快速繁育有重要作用,而且芽茎也可作为老鸦瓣物种进化和生态适应的重要标志,所以对老鸦瓣芽茎进行深入的发育特征研究并探索其形成机制,具有重要的理论和实践意义。本研究以老鸦瓣芽茎为研究对象,先筛选诱导芽茎的最佳条件,在此基础上,针对老鸦瓣芽茎的发生发育过程,综合运用结构植物学、植物生理学、分子生物学、生物信息学等多学科研究手段,进行形态解剖特征、生理生化变化、转录组及小RNA分析等研究,阐明芽茎的发生特征及膨大过程,并初步揭示其形成和膨大机理,为芽茎生长调控研究提供理论依据,最终实现老鸦瓣的规范化栽培以解决其资源困局。同时本研究也可为百合科具有类似结构植物的研究提供理论参考。本研究的主要内容及结果如下:(1)研究种球大小、栽培密度、栽培基质、栽培深度以及水分对老鸦瓣生长及芽茎发生的影响,结果表明年生较短的2级、3级和4级种球有利于芽茎的发生,用于芽茎诱导;3级和4级种球增产效果明显,作繁殖种球用,供生产商品鳞茎。采用高密度1000株·m-2种植的老鸦瓣有利于提高其产量并诱导芽茎发生。应用大田表土混入一定量的营养土的栽培基质节约成本,利于诱导芽茎和保证老鸦瓣的产量。覆土深度0.5 cm、5 cm处理的老鸦瓣主要采取芽茎的更新方式,可用于芽茎的诱导,同时采用覆土深度5 cm处理来实现老鸦瓣的增产。充足水分(80%田间持水量)、干湿交替的水分处理有利于芽茎的诱导,同时干湿交替可作为老鸦瓣高效栽培的水分管理提高其产量和水分利用率。(2)在芽茎诱导的基础上,通过形态解剖、石蜡切片等方法,观察了老鸦瓣芽茎形态发生发育的特点,发现芽茎发生在靠近鳞茎盘侧面的茎基部,由茎基部底端向外凸出,继续向下伸长生长,呈圆柱状,外侧光滑,无明显的节与节间。芽茎发生部位的内部分生细胞不断进行垂周分裂和平周分裂,逐步发育形成突起生长锥,同时芽原基生长,内部细胞也发生了大量的分裂,引起了茅茎的发生。芽茎形成后期茅原基继续生长成芽,生长锥同时生长,分化成多个原基,引起茅茎的伸长,为形成小鳞茎作准备。芽茎形成过程中的原形成层束发达,便于芽茎形过程中水分和养分的运输。(3)对老鸦瓣芽茎形成过程中碳水化合物及相关酶,蛋白质和内源激素的变化进行动态测定,结果显示可溶性总糖、蔗糖、还原糖、果糖和淀粉含量在芽茎发生的形成中期均显著增加,且在芽茎形成后期仍维持较高的水平,然而蛋白质含量在芽茎形成过程中持续下降。淀粉酶(AMY)、蔗糖磷酸合酶(SPS)和蔗糖合酶(SS)的活性均在芽茎形成前期达到最高值,且均与可溶性糖呈负相关;腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的活性随着芽茎的形成逐渐升高,可溶性淀粉合成酶(SSS)和颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)的活性呈单峰曲线变化,最高值均出现在形成中期。AGPase、SSS、GBSS三者活性与淀粉含量呈正相关,其中GBSS活性与淀粉含量呈显著正相关。赤霉素(GA)和玉米素核苷(ZR)含量在芽茎形成前期达到最高值,在整个形成过程中呈下降趋势。吲哚-3-乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)在芽茎形成前期和中期保持较高的含量水平,但在形成后期含量显著下降。ABA/IAA的比值变化与IAA、ABA相反,在茅茎形成前期和中期较低,而在形成后期大幅上升。因此在众多酶作用下引起的可溶性糖和淀粉积累,连同高含量的IAA及低比值ABA/IAA,共同作用于芽茎的发生。同时推测显著上升的蔗糖、还原糖可能是诱导芽茎发生的信号分子。(4)测定老鸦瓣芽茎膨大过程中碳水化合物及相关酶,蛋白质和内源激素的动态变化,结果表明可溶性总糖、蔗糖、还原糖和果糖含量在芽茎膨大过程中基本上呈下降趋势,然而淀粉和蛋白质含量在芽茎膨大过程中持续上升。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的活性在膨大前期达最高值,并在膨大中期保持较高的活性;蔗糖合酶(SS),可溶性淀粉合成酶(SSS)和颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)活性的变化趋势一致,在芽茎膨大过程中均呈上升趋势。SS活性与蔗糖含量呈显著负相关,但与淀粉含量、SSS及GBSS活性呈显著正相关。赤霉素(GA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、玉米素核苷(ZR)在芽茎膨大前期达峰值,且在膨大中期仍维持较高的含量水平,在膨大后期均显著下降。脱落酸(ABA)含量在芽茎膨大中期之前大幅度上升,其含量从芽茎膨大中期至膨大后期显著下降。ABA分别与IAA、GA和ZR的比值的最低值均出现在芽茎膨大前期。因此老鸦瓣芽茎的膨大过程是新鳞茎形态发生并伴随着淀粉积累的过程,淀粉积累是SS催化蔗糖分解的产物在AGPase、SSS和GBSS的共同作用下完成的。低含量的ABA及低比值ABA/IAA、ABA/GA和ABA/ZR有利于芽茎的初步膨大;高含量的GA,IAA和ZR协同可溶性糖共同促进芽茎的膨大从而诱导新鳞茎的形成。(5)利用转录组测序技术对老鸦瓣芽茎的三个发育阶段进行转录组分析,测序共获得原始数据15.49 Gb,通过拼接获得了 74,006条Unignes。从这些序列中共筛选到2,484个SSR标记。通过比较三个转录组文库中基因的表达丰度,5,119个基因显示出至少在一个组合中差异表达。用GO、COG、KEGG数据库对差异基因进行注释,功能注释显示这些差异基因主要涉及物质及能量代谢、激素信号、细胞生长、转录调控等诸多生理生化过程。此外,荧光定量PCR验证表明差异基因表达与转录组数据较为一致,进一步证明了差异表达基因参与了芽茎的形成。(6)利用Illumina高通量测序技术对老鸦瓣芽茎发生的三个过程的老鸦瓣芯芽样本进行测序,测序共得到了 12,890,912、12,182,122和12,061,434条clean reads。在老鸦瓣所有miRNAs的reads中,共鉴定出了 88个保守miRNAs,同时有70个unique sequences被预测为新的miRNAs。对这些miRNAs进行靶基因预测,总共有122个miRNAs预测到了 531个靶基因。进一步使用GO、COG和KEGG数据库对靶基因进行功能预测与注释,有助于更好地对基因功能进行探索。在老鸦瓣芽茎发育的不同时期,对miRNAs及其相应靶基因的表达谱做进一步分析。结果显示,miR165、miR396、miR1886.2、miR2094、miR397等可能在调控老鸦瓣芽茎发育过程中发挥着重要作用。(7)经转录组和RT-PCR技术分析,芽茎形成过程中编码糖合成和糖代谢相关酶的基因表达验证了糖合成及糖代谢过程中相关酶活性的变化,调控细胞生长的基因在芽茎发生过程中表达量显著提高,参与细胞生长。与生长素极性运输的基因表达显著变化,参与芽茎的生长。ath-miR165a、zma-miR396g-5p与ath-miR1886.2是芽茎形成过程中的重要调控因子。zma-miR396g-5p、osa-miR2094-5p、ptc-miR7839的靶基因参与碳水化合物运输与代谢。