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目的:研究供体肝脏NK细胞在同种异体大鼠肝脏移植中的作用,以及比较外周血中淋巴细胞亚群的变化,初步探索供肝NK细胞在肝移植免疫中的可能机制。
方法:运用改良“二袖套”法建立大鼠肝移植模型,以Lewis-BN近交系大鼠为急性排斥组,BN-Lewis近交系大鼠为天然耐受组,并应用Co60射线照射清除供体免疫细胞及经门静脉供肝NK细胞回输等技术,设立6个大组:A.天然耐受组(BN-Lewis);B.BN-Lewis+供体Co60照射(Co60-BN-Lewis);C.BN-Lewis+供体Co60照射+受体门静脉输注供肝NK细胞(Co60-BN-Lewis+donor NK cells);D.急性排斥组(Lewis-BN);E.Lewis-BN+供体Co60照射(Co60-Lewis-BN),F.Lewis-BN+供体Co60照射+受体门静脉输注供肝NK细胞(Co60-Lewis-BN-donor NK cells)。根据不同观察时间点分别于术后1、3、7天切取移植肝用于病理学分析,同时收集外周血,血清用于检测肝功能指标、IL-2水平,全血行流式检测淋巴细胞亚群情况。另外设亚组观察移植后一般情况和自然存活时间。
结果:BN-Lewis耐受组中,B、C组平均存活时间较A组缩短,但3组间差异比较无统计学意义(P>0.05);3组中,A组术后一般情况恢复最好,移植相关并发症发生率最低,C组其次,B组最差,其中B组并发症发生率与A组、C组比较均有统计学意义(P<0.05)。Lewis-BN排斥组中,E、F组平均存活时间较D组明显缩短,3组间两两比较均有统计学意义(P<0.05);3组中,D组术后一般情况恢复最好,移植相关并发症发生率最低,F组其次,E组最差,其中E组并发症发生率与D组、F组比较均有统计学意义(P<0.05)。
回输供肝NK细胞移植组术后血清转氨酶升高,于术后第3天达到峰值,之后开始下降。未行NK细胞输注的其他移植组中,均未见术后第3天的肝功能破坏现象。与之相应,回输供肝NK细胞组引起移植术后胆红素的升高,变化趋势与其他移植组别相似,都呈逐渐上升趋势,但F组术后第7天升高幅度较其他组别明显。
移植肝组织Banff标准评分:各组的排斥反应有一相似的趋势,随移植后时间延长,急性排斥反应加重。术后第7天,各组排斥反应均达到高峰。耐受组中,B组排斥反应最重,其余两组为中度排斥;排斥组中,E组和F组为重度排斥,D组为中度排斥反应。
回输供肝NK细胞引起CD4+CD25+Treg比例升高:耐受组中,C组第3、7天与A组、B组相应时间点相比,该比例均明显升高。排斥组中,F组第7天与D组、E组相应时间点相比,该比例均明显升高。差异均有统计学意义(P<0.05)。
回输供肝NK细胞引起受体CD3+CD8+T细胞比例下降:耐受组中,第1、7天C组与A组,第7天C组与B组相比,CD3+CD8+T细胞比例比例明显下降。排斥组中,第7天F组与D组,第3、7天F组与E组相比,该比例明显下降。差异均有统计学意义(P<0.05)。回输供肝NK细胞引起受体CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值升高与受体CD3+CD8+T细胞比例下降的趋势呈反方向一致性。
回输供肝NK细胞下调血清IL-2水平:耐受组中,第3、7天C组与B组比较,血清IL-2水平明显降低。排斥组中,第7天F组与E组比较,血清IL-2水平明显下降。差异均有统计学意义(P<0.05)。回输供肝NK细胞移植组与相应的清除供肝免疫细胞的移植组,血清IL-2水平的降低与外周血CD4+CD25+Treg比例的升高呈反方向一致性。
结论:
1.供肝NK细胞能减轻肝移植术后早期的急性排斥反应,从而延长受鼠远期存活时间或提高远期存活率,且可以改善移植术后生存质量及促进术后一般情况恢复,减少并发症的发生率。
2.供肝NK细胞通过上调CD4+CD25+Treg比例来减轻移植肝淋巴细胞浸润、降低CD3+CD8+T细胞比例及移植物内IL-2水平,在肝脏移植免疫中发挥调节作用,从而下调受体细胞免疫水平,减轻早期的急性排斥反应损伤。