论文部分内容阅读
G蛋白调节子（regulators of G protein signaling，RGS）通过上调G蛋白α亚基的GTP酶活性，促进G蛋白α亚基和βγ亚基的结合，从而负调节Gα亚基的活性。Sst2是最早发现的存在于低等真核生物酿酒酵母细胞中的1种RGS蛋白，它能使因蜕皮素作用而停滞于细胞周期G1期的酿酒酵母细胞顺利进入S期，恢复增殖状态。RGS16在酵母细胞中有类似Sst2的功能并且可以减弱血小板激活因子对p38MAPK的激活作用。在CEM细胞中蛋白激酶C可以通过上调TNF-α而诱导RGS16的表达，另外有人发现TNF-α通过p38MAPK磷酸化p53从而诱导细胞凋亡或抑制细胞周期运行，但是ERK通路的信号拮抗p38MAPK对细胞周期从G1期向S期过度的抑制。另外，Buckbinder发现p53可以诱导RGS16的表达。因此我们推测p38MAPK、p53和RGS16之间可能存在一种反馈关系。为了观察RGS16、p38MAPK对细胞周期和凋亡的作用以及它们与p53之间的关系，我们将外源性基因pCMV5-RGS16和pCMV5-p38分别或共转染导入C6细胞；同时用p38MAPK的抑制剂SB-202190处理转染pCMV5-P38前后C6细胞，观察它们对细胞的影响，并在转染pCMV5-RGS16和pCMV5-p38基因后，用免疫细胞化学方法观察RGS16和p38MAPK的蛋白表达以及p53的蛋白磷酸化情况，为探索p38MAPK和RGS16蛋白之间的关系以及p38MAPK在C6细胞中的作用提供依据。 目的：（1）观察RGS16对C6细胞周期和增殖的影响；（2）观察p38MAPK对C6细胞周期变化和细胞凋亡的作用；（3）初步探讨p38MAPK诱导C6细胞周期抑制和细胞凋亡的机制。 方法：利用脂质体介导法将pCMV5-RGS16和pCMV5-p38基因分别或共转染导入C6细胞中；用p38MAPK抑制剂SB-202190处理处于对数生长期的转染和未转染p38MAPK的C6细胞，24-36小时后在倒置显微镜第四军医)（学硕士学位论文1下观察细胞形态变化和贴壁情况；‘H．TdR法检测C6细胞在转染不同梯度pCMVS｝ 和 pCMVS质粒后的增殖情况；免疫细胞化学法检测转染前后 p38MAPK和 RGS16蛋臼的表达变化和 p53蛋白的磷酸化情况；流式细胞仪检测细胞周期变化和细胞是否有凋亡发生。 结果：门）转染pCMVS卫GS16质粒后，RGS16蛋白的24h开始表达，36h时表达率最高，72h时后表达终止；C6细胞的各期细胞比例变化与RGSI6蛋白表达对应，在36h时G；期比例认转染前的70．5％降低到60二％，S期比例从20．9％增加到349％：但在48h时Q期增加到762％S期减少到门．4％；72h时各期恢复到正常比例c对照组细胞转染前后形态变化不明显，RG引6蛋白表达阴性，细胞周期变化不明显。（二〕3N－TdR法检测显示C6细胞增殖速度与转染社＼IV5－RG引6的量呈正相关；（3）转染pCMVS－p38MAPK和／或pCMVS－RGS16质粒36h后p38N4pPK和RGSI6蛋白均表达阳性；转染pCMVSf38MAPK组出现33．8％的凋亡峰，细胞周期结果显示 GI 期细胞百分数增加 17o／b，而 S期细胞百分数减少14％；共转染pCMVS－p38MAPK和 pCMVS－RGS6组未出现的凋亡峰，细胞周期结果显示m期和 S期细胞百分数变化与未处理组之间没有明显差别；但共转染pCMVS？38MAPK和 pCMVS组出现的周亡峰，细胞周期结果显示GI期和S期细胞百分数变化与转染pCMVS巾 组之间很接近；SB－2021 90处理的未转染组细胞周期结果显示 GI期细胞百分数减少 18％，而 S 期细胞百分数增加 旧％；SB－2021 90 能对抗pCMVS－p38MAPK对C6细胞周期的影＊。（）转染pC＼4Y’5－p38NIAPK质粒36h后免疫细胞化学法检测p53强阳性，而未转染p38NIAPK的细胞和 SB－202190处理转染pCNIVS－p38MAPK后的细胞组中p53阴性。 结论：（l）RGS 6可能促进 C6细胞增殖和细胞周期的运行；门）p38MAPK可以抑制大鼠胶质瘤 C6细胞周期运行和诱导其凋亡；（3）RGS16和 SB202190有桔抗p38MAPK丫用，并且可以促进C6细胞增5白 …)p38MAPK可能通过p53抑制大鼠胶质瘤C6细胞周期运行和诱导其凋亡。