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过氧化物酶(peroxidase,POD,EC 1.11.1.7)是一类广泛存在于生物中的氧化还原酶。过氧化物酶的血红素基团通常是铁原卟啉Ⅸ,其包含四个与Fe(Ⅲ)相连的吡咯环。H2O2可以与过氧化物酶活性中心的血红素相互作用,将过氧化物酶活化为反应中间体,介导氧化还原反应。Ⅲ类过氧化物酶-过氧化氢酶超家族在植物中广泛存在,通常会分泌到细胞壁、质外体或液泡中,并在木质素前体、生长素和次生代谢产物的氧化中起作用。蛋白磷酸酶是一类可以将磷酸化的物质脱去磷酸基团,从而使物质去磷酸化的酶。蛋白磷酸酶与蛋白激酶的作用相辅相成、缺一不可,在生物的生命活动,如细胞分裂、信号传导、RNA剪接、DNA修复、原癌基因和抑癌基因的表达等过程中,发挥着不可替代的作用。黍子过氧化物酶(proso millet peroxidase,PmPOD)是一种从黍子中提取的植物过氧化物酶,其典型特征是含有血红素辅基。PmPOD不仅具有依赖于血红素辅基的过氧化物酶活性,同时也具有不依赖于血红素辅基的磷酸酶活性。在体外,PmPOD可以发挥其磷酸酶活性,如PmPOD会使DNA的磷酸二酯键或脱氧核糖核苷-5’-一磷酸(deoxyribonucleoside-5’-monophosphates,dNMPs)的磷酸酯键断裂。前期实验结果表明Mg2+在PmPOD水解底物磷酸基团的过程中发挥着促进作用。然而Mg2+增强PmPOD磷酸酶活性的机制以及PmPOD发挥磷酸酶的活性位点尚不清楚。因此,本论文将从以下三方面进行研究:1、首先探究了 Mg2+在PmPOD发挥磷酸酶活性水解dNMPs过程的影响和机制。通过实验研究,结果表明:在PmPOD与底物的结合过程中,Mg2+先和dNMPs结合形成反应复合物,此复合物再与PmPOD进行结合,从而水解磷酸基团。通过荧光光谱分析,Mg2+可以使PmPOD荧光基团的淬灭方式由动态改变为静态。另外,Mg2+可以增加PmPOD和dNMPs反应的结合常数Ka约2～10倍以及水解速率V约3～13倍(与不存在Mg2+相比),其中dCMP的Ka和V均最大,而dAMP的Ka和V最小。2、将PmPOD中包含预测的磷酸酶活性位点的片段(147-296 aa)所对应的基因序列构建到表达载体pET-32a上,进行原核重组表达。通过亲和纯化层析、复性以及质粒切割等实验过程,得到了具有活性的重组截短型PmPOD(truncate proso millet POD,tPmPOD);3、将PmPOD预测的磷酸酶活性位点HCXXXXXR(X为任意氨基酸)中的保守氨基酸His191、Cys192、Arg198、与活性位点中的Cys192形成二硫键的Cys219和具有酸碱催化作用的Asp225均突变为非极性氨基酸丙氨酸A(Ala),得到五种突变体蛋白质。通过高效液相色谱和荧光光谱,来研究PmPOD发挥磷酸酶的活性位点。结果表明,将上述五个位点分别突变后,与tPmPOD相比,突变体蛋白质磷酸酶活性的结合常数和反应速率分别降低1.5～3.7倍和2.2～14.8倍。其中在水解底物过程中,tPmPOD-C192A的磷酸酶活性最低,其结合常数和水解速率分别降低3.7和14.8倍。这五个位点均对PmPOD磷酸酶活性的发挥起着重要作用,其中,Cys192作为催化的亲核基团,而Cys219与Cys192形成二硫键来保护其巯基的稳定,这对于PmPOD发挥磷酸酶活性至关重要。