论文部分内容阅读
球虫病是一种全球性的原虫病,它是集约化养鸡业最为常见、多发、且危害严重的疾病之一。多年来,该病防治主要依靠药物,但因抗药虫株不断涌现以及药物残留等问题,利用免疫预防来取代药物控制球虫病已成为人们的共识。免疫毒素是一种导向药物,将堆型艾美耳球虫单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE40基因连接,装入表达载体pET-22(b)+中,以获得重组毒素,研究其对堆型艾美耳球虫的杀灭作用。 将含外毒素的绿脓杆菌ATCC27853培养上清2ml接种21日龄的健康公雏鸡,接种后18～40小时内小鸡全部死亡,显示其具有作为免疫毒素弹头的潜力。根据GeneBank发表的绿脓杆菌外毒素基因全序列,设计引物,引入HindⅢ酶切位点。采用PCR方法扩增PE40基因,纯化PCR产物与pMD18-T simple载体连接构建质粒pT-PE40,蓝白斑筛选阳性克隆。质粒pT-PE40经HindⅢ酶切显示2692bp和1101bp两条带。与PA103相比,质粒pT-pE40的测序结果显示ATCC27853的PE40肽段的重要活性位点均与PA103相同。 含ScFv基因的质粒pET22-ScFv已经构建,用HindⅢ对质粒pT-PE40和pET22-ScFv分别进行双酶切,利用HindⅢ酶切位点将PE40基因亚克隆到pET22-ScFv载体上构建融合毒素pET22-ScFv-PE40。将重组质粒转化JM109宿主菌。转化菌液涂于含氨苄青霉素(50ug/ml)LB平板培养基上进行培养,挑选菌落分别接种于含氨苄青霉素(50ug/ml)的LB培养液中,用Sal Ⅰ和Not Ⅰ对提取的质粒进行双酶切鉴定,得到1114bp和6181bp目的基因片段。测序鉴定插入方向,选取以PE40基因5’端与ScFv基因3’端连接的重组质粒pET22-ScFv-PE40。 抗堆型艾美耳球虫重组质粒pET22-ScFv-PE40经1mmol/L IPTG诱导,成功地表达约68KD的目的蛋自。表达产物以可溶形式存在于上清中。使用抗PE多克隆抗体对目的蛋白进行蛋白印迹分析,表达产物与抗PE多克隆抗体发生抗原抗体反应,融合基因得以成功地表达。 将诱导获得的ScFv-PE可溶性表达产物,加入含有脱囊后的子孢子的1640培养液中,观察14h内活动的子孢子数目和活动性的变化,结果与对照组相比,加入重组毒素组的活动子孢子数目明显减少(P<0.05),活动性明显降低,提示重组毒素对鸡堆型艾美耳球虫子孢子具有较强的杀灭作用。从而为鸡堆型艾美耳球虫病的免疫控制研究提供技术手段和理论依据。