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研究目的：复制炎性胸腔积液大鼠悬饮模型,选择水通道和离子通道为指标,观察其在悬饮形成中的作用,为阐明悬饮形成的病理机制,同时观察经方“十枣汤”对悬饮模型大鼠的治疗作用。通过十枣汤治疗前后的对比,动态观察指标的变化情况,从水和离子通道途径探讨悬饮形成的病理生理机制及十枣汤治疗作用机理。研究方法：1.实验动物及分组：雄性SPF级Wistar大鼠72只,鼠龄6-8周,体重150-200g用简单随机法分为对照组(8只)、模型组(32只)、治疗组(32只),模型组、治疗组根据胸腔内注入角叉菜胶后处死时间,再分为12、24、36、及48小时组,每组8只。2.造模方法：复制炎症性胸腔积液大鼠模型作为悬饮模型,模型制作参照Cuzzocrea等的方法。大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉,75%酒精消毒后,在其右侧剑突与肋弓交界处胸腔穿刺,模型组、治疗组胸腔内注射1%角叉菜胶溶液0.2mL,对照组则注射等体积生理盐水。3.给药方法：造模完成后,治疗组则分别在造模后6、10小时以200%的十枣汤10mL/kg/次灌胃(十枣汤峻下逐水之力较强,本研究采用短期共2次的给药方案,以体现“中病即止”的要求),模型组则于相同时间灌胃等体积生理盐水。4.取材：分别于注入角叉菜胶12、24、36、48小时后,腹主动脉放血处死大鼠,对照组于注入生理盐水24小时后处死。从剑突处沿胸骨剪开皮肽和胸骨,暴露双侧胸腔。观察胸腔积液的分布及胸膜粘连程度。吸取双侧胸腔渗出液,用1mL注射器准确计量,常规方法进行白细胞计数及分类。分别取壁层、脏层胸膜标本,部分组织固定于10%中性福尔马林液中,余下组织置-80℃冰箱中,用于总RNA和蛋白的提取。5病理切片：取固定于福尔马林液中的组织,酒精脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋,连续冠状切片,片厚3um,做切片的HE染色,镜下观察胸膜组织炎症程度。6免疫组化：常规石蜡包埋,切片,经脱蜡,漂洗,修复后加一抗(AQP1,1:50;ENaC,1:30;CFTR,1:50)恒温1小时,在加生物素化二抗(AQP1,CFTR:山羊抗兔；ENaC:兔抗山羊)37℃恒温箱内20分钟；PBS洗后加入SABC显色1-5分钟,然后苏木素浅复染,常规脱水、封片、分析结果。7.实时荧光定量(RT-PCR)方法检测AQP1、ENaC和CFTR基因表达：胸膜组织总RNA的提取按照Trizol Reagent,总RNA抽提试剂(]nvitrogen公司)说明书进行,所有器具均用DEPC处理过的灭菌水清洗。取2ug总RNA用作cDNA的合成,反应体积为20uL,采用逆转录试剂盒lnvitrogen公司)。逆转录产物分别进行AQP1、ENaCα亚基(α ENaC) cDNA片段的扩增。RT-PCR物凝胶电泳,用凝胶成像系统配套软件处理图像,进行定量分析,计算结果。8.统计学处理：数据统计采用SPSS13.0软件进行分析,组间比较采用重复测量资料的方差分析进行检验,检验水准p=0.05,若组间变量和时间之间存在交互效应,进一步使用独立样本t检验进行分析,检验水准为p=0.05。研究结果：1.动物一般情况正常组大鼠：大鼠活泼好动,反应灵敏,毛发洁白光泽,食欲旺盛,二便正常,无咳嗽,气促等异常体征。模型组大鼠：大鼠精神萎靡,反应迟钝,毛发枯槁发黄,食欲较差,普遍出现气促,偶可闻及咳嗽。治疗组大鼠：大鼠精神稍差,反映迟缓,食欲较模型组尚可,大便稍溏,小便增多,稍有气促。2.胸水分析：造模大鼠胸腔内皆可见到淡黄色胸腔积液产生,偶有胸膜粘连。注入角叉菜胶后模型组大鼠胸膜腔有明显渗出,模型组各时点胸水量分别为：12h(0.6563±0.678)(单位mL下同)、24h(1.0625±0.220)、36h(0.7063±0.729)、48h(0.4375±0.187);24小时达高峰,36小时后下降,至48小时仅有少量的液体渗出;治疗组也呈现相似的规律,各时点胸水量分别为12h(0.5000±0.080)、24h(0.7750±0.776)、36h(0.5063±0.904)、48h(0.2000±0.964)。与模型组同时点比较,渗出液明显减少且差异具有统计学意义(P<0.05);而对照组未见胸腔积液。将收集到的胸水进行常规检验,注入角叉菜胶后胸腔积液白细胞总数升高且以多核细胞为主治疗组比与模型组比较白细胞总数有降低的趋势,但无统计学差异(P>0.05)3.病理切片炎症程度：光镜下观察：HE染色显示,对照组胸膜间皮完整,呈扁平状,单层排列,间质未见水肿及炎细胞浸润。模型组均可见胸膜间质明显增厚并显著水肿,大量炎细胞弥漫浸润,可见小脓肿形成,部分区域间皮细胞脱落。治疗组亦可见胸膜间质轻度水肿,炎细胞散在浸润,但较模型组为轻。4.大鼠胸膜组织AQP1、ENaC和CFTR蛋白表达的检测结果免疫组化显示对照组和胸膜炎组大鼠脏、壁层胸膜间皮细胞和毛细血管内皮细胞均呈棕黄色染色,表明胸膜组织上存在AQP1、ENaC和CFTR蛋自表达。染色信号显示脏层胸膜AQP1表达强于壁层胸膜,模型组及治疗组表达均比对照组增强；尤以24h组表达最强,染色信号呈粗颗粒状,棕黑色；治疗组同时点表达强度比模型组同时点弱,阳性细胞数比较差异具有统计学意义(P<0.05)。ENaC,CFTR基因也呈现类似规律。模型大鼠胸水量呈规律变化,5大鼠胸膜组织AQP1、ENaC和CFTR基因表达的检测结果：大鼠胸膜组织中,正常组相比模型组及治疗组AQP1基因表达均有上升差异有统计学意义(P<0.05)。模型组中AQP1基因表达量12h开始升高,24h组基因表达达到最高。然后表达量逐渐下降。治疗组页呈现同样规律。治疗组与模型组相同时点比较,治疗组较模型组表达量有所下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。ENaC,CFTR基因也呈现类似规律。结论：造模组大鼠胸水量呈规律变化,模型组胸水量24小时达高峰,36小时后开始下降,至48小时仅有极少量的液体渗出,治疗组也有相似的规律,但与模型组同时点相比较,胸水量明显减少；胸水中白细胞总数升高且以多核细胞为主,治疗组与模型组比较总体有降低趋势；大鼠胸膜病理切片显示治疗组各时点胸膜间质水肿及白细胞浸润均比模型组同时点为轻,说明十枣汤可以促进悬饮模型大鼠胸腔积液的吸收,并能降低炎性细胞的浸润,提示十枣汤对悬饮(炎性胸腔积液)有一定的治疗作用。造模组大鼠胸膜组织中AQP、ENaC和CFTR蛋白表达及基因表达水平均较正常组上调,提示以上水通道及离子通道均参与炎性胸腔积液(悬饮)的液体转运过程。治疗组较模型组同时点水通道及离子通道表达水平低,提示十枣汤可以调节水通道及离子通道的表达水平,促进胸腔积液的转运,治疗悬饮(炎性胸腔积液),其作用机制可能与其下调水通道离子通道蛋白表达有关。