【摘 要】
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果胶酶可以促进果胶类聚合物中的α-1,4糖苷键断裂生产果胶低聚糖,在动物饲料、果浆工业、造纸行业、纺织行业等都有很强的运用潜力,特别是在纺织行业的苎麻脱胶工艺中。传统工艺中一般使用强碱溶液在高温下,除去苎麻纤维中的果胶质、蜡质等纤维共生物杂质,但由于碱精练过程中大量使用了烧碱和表面活性剂,处理后需要用大量的酸中和并用大量的水清洗,因此,被处理的苎麻纤维损失较大,强度也损伤严重。此外,该工艺用水量大
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果胶酶可以促进果胶类聚合物中的α-1,4糖苷键断裂生产果胶低聚糖,在动物饲料、果浆工业、造纸行业、纺织行业等都有很强的运用潜力,特别是在纺织行业的苎麻脱胶工艺中。传统工艺中一般使用强碱溶液在高温下,除去苎麻纤维中的果胶质、蜡质等纤维共生物杂质,但由于碱精练过程中大量使用了烧碱和表面活性剂,处理后需要用大量的酸中和并用大量的水清洗,因此,被处理的苎麻纤维损失较大,强度也损伤严重。此外,该工艺用水量大、能耗高、耗时长,废液中COD值很高是一种非绿色的加工工艺。为此,作为生物脱胶过程中的至关重要酶制剂,碱性果胶酶的研发以及其在苎麻脱胶中的应用,使绿色、温和的生物脱胶技术成为可能。在碱性条件下,作为苎麻纤维主体的纤维素有润胀的趋向,而果胶酶利用其专一性有效分解去除在苎麻纤维表面对蜡质等疏水性共生物起黏结作用的果胶质,使疏水性物质从苎麻纤维表面脱落,从而达到精练效果,而纤维本身不受到损伤。因此,经生物脱胶后的苎麻纤维能最大程度的保持纤维强度,失重小,手感柔软厚实,且富有弹性。并且可节约大量工艺用水、生产时间、能耗、原料及对废水的处理费用,减少对环境排放水中的盐含量及COD等。因此,成本更低廉、活性更高的碱性果胶酶成为纺织工业的关注热点。本实验对Bacillus subtilis168来源的碱性果胶酶基因(pel168)分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行表达。表达酶液经纯化后进行SDS-PAGE检测,结果显示,在大肠杆菌中表达的蛋白(PEL168E)与我们所推测的蛋白分子量相同,大小为46kDa。然而在酵母中表达的蛋白(PEL168P)经SDS-PAGE检测以后却有两条带,大小分别为48.6kDa和51.4kDa,因此我们用去糖基化酶对PEL168P经行处理,验证后发现它确实被糖基化。酶学性质的研究表明,该酶的最适温度为50℃,最适PH为9.4。当PEL168E和PEL168P分别在60℃水浴锅中处理20分钟以后,PEL168E完全失去活性,而PEL168P还保留了26%的残余活性。PEL168P的比酶活为1320U/mg, Km值和Vmax分别为0.09mg/ml以及18.13μmol/min。K+,Li+,Ni2+和Sr2+对其活性没有影响,而Mn2+,Hg2+和Cu2+几乎完全抑制了酶的活性,Zn2+,Fe3+,Mg2+和Co2+也部分抑制酶的活性,但是当有适当浓度的Ca2+参与反应时,该酶的活性能提高38%以上与此同时,为了提高其在酵母中的表达水平,我们利用酵母密码子的偏爱性及简并性对pel168基因经行了优化,其中有294个碱基被优化,优化后的基因转入毕赤酵母中进行异源蛋白(PEL168S)表达。挑选具有相同拷贝数的优化前和优化后基因的酵母重组菌株,在相同的环境下甲醇诱导72h,发现密码子优化后PEL168S的酶活是优化前PEL168P的1.52倍。通过Realtime-PCR检测到所筛选的高拷贝重组菌株最多整合了11个拷贝的果胶酶酶基因pel168s。除此之外,对于PEL168P在苎麻脱胶和生物煮练中的应用也进行了一系列的测定,结果表明碱性果胶酶在纺织工业的绿色生产中起着重要的作用。
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