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研究背景:传统化疗药物大多针对快速分裂的细胞,因肿瘤细胞异质性大,除快速增殖的肿瘤细胞群落外,尚存在增殖缓慢的肿瘤细胞群落,此外,正常组织细胞中同样存在不断分裂增殖的细胞。因此单纯应用传统化疗药物往往面临着疗效有限且杀伤正常组织细胞等不足。因此如何增加药物的靶向性,提高药物疗效以及安全性显得尤为重要。20世纪20年代提出的Warburg效应发现肿瘤细胞的代谢特征:即使在有氧环境下,肿瘤细胞依然依赖糖酵解而非有氧氧化来满足肿瘤自身的能量及生物合成需求。肿瘤细胞的有氧糖酵解与肿瘤形成的因果关系尚存争议,在淋巴瘤中的研究正逐步开展。有研究表明,肿瘤细胞代谢表型的改变为PI3K/Akt/mTOR、HIF-1α以及原癌基因c-MYC等基因主动调控的代谢重编程所致,而非肿瘤细胞因有氧氧化主要结构线粒体受损而导致的被动应答,且此种代谢表型偏倚可逆。研究目的:我们推测,使用糖酵解抑制剂抑或PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂,通过直接或间接途径抑制肿瘤细胞的糖酵解,能增敏化疗药的抗肿瘤效应,同时降低化疗药的药物剂量以减少副作用。因肿瘤细胞的代谢表型偏倚可逆,故协同应用有氧氧化抑制剂,旨在阻碍肿瘤细胞的双代谢通路,即有氧氧化与糖酵解,充分削弱肿瘤细胞的高合成的物质来源及高代谢的能量来源。本研究论文主要包括三个部分:（一）初发弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL）患者肿瘤组织中HIF-1α、糖酵解及有氧氧化相关关键蛋白表达与患者的预后分析;（二）糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose,2DG）、mTOR抑制剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）增加弥漫大B细胞淋巴瘤SUDHL-4与Burkitt淋巴瘤Raji细胞株对阿霉素（Doxrubicin,DOX）敏感性的机制研究,以及分别联用有氧氧化抑制剂寡霉素（Oligomycin,OM）探究双代谢通路抑制对化疗药DOX的增敏作用;（三）探究蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib,BTZ）单独应用及联用OM后对SUDHL-4与Raji细胞株的作用机制。研究方法:为探究HIF-1α-糖酵解-有氧氧化通路异常对DLBCL的预后意义,对83例初发DLBCL患者免疫组化、血清生化、PET/CT代谢活性等进行回顾性分析,检测患者淋巴瘤组织中糖酵解及有氧氧化通路相关蛋白低氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）、己糖激酶（hexokinaseⅡ,HKⅡ）与琥珀酸脱氢酶（succinodehydrogenase,SDHA）蛋白表达水平并进行预后分析。为研究2DG与RAPA是否增加DLBCL与Burkitt淋巴瘤（Burkitt lymphoma,BL）细胞株对DOX的敏感性;RAPA是否同样具有抑制糖酵解途径的作用;以及联用有氧氧化抑制剂OM后通过对糖酵解与有氧氧化的双重抑制,是否更加显著增敏DOX对弥漫大B细胞淋巴瘤SUDHL-4与Burkitt淋巴瘤Raji细胞株的杀伤作用;首先体外培养SUDHL-4与Raji细胞,以正常人外周血淋巴细胞为对照,CCK8法检测OM与RAPA对正常淋巴细胞及淋巴瘤细胞的增殖抑制率;将2DG、RAPA与DOX联合作用,以及在OM与RAPA合用背景下与DOX联合作用于SUDHL-4及Raji细胞株,应用CCK8法检测细胞增殖抑制率;Glucose（HK）Assay Kit检测葡萄糖消耗、乳酸（Lactic acid,LD）测试盒检测乳酸含量及Succinate Colorimetric Assay Kit检测琥珀酸生成;Western Blot检测HIF-1α及其下游血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）以及糖酵解途径关键酶HKⅡ、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDHA）及有氧氧化关键酶SDHA蛋白表达水平;反转录实时定量PCR（Reverse transcription and quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测HIF-1α、HKⅡ、LDHA及SDHA基因转录水平;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡、PI单染法检测细胞周期。为探索BTZ与OM联用对DLBCL与BL细胞株的作用效应及机制,将不同浓度BTZ单用及与OM联用于Raji和SUDHL-4细胞,CCK-8法检测细胞增殖抑制率;代谢试剂盒检测葡萄糖、乳酸和琥珀酸浓度;RT-qPCR检测代谢途径关键酶及蛋白的基因转录水平变化;Western blot法检测蛋白表达水平;流式细胞术分析细胞凋亡。研究结果:83例初发DLBCL患者回顾性分析,单因素分析显示初发DLBCL患者Ki67、LDH、PET/CT检测SUVmax、IPI、Ki67hiBCL-2+、HIF-1α、HKⅡ与SDHA等与PFS和OS显著相关。HIF-1α、HKⅡ、SDHA均异常表达组(HIF-1α+HKⅡhi SDHAlo,H-H-S)与不全异常表达组（non H-H-S）,两组间的预后危险因素LDH、Ki67、初发SUVmax、IPI评分均具有显著的组间差异（P<0.05）。H-H-S组与non H-H-S组的3年PFS率分别为14.3%与78.3%（P=0.001）,3年OS率分别为14.3%与89.9%（P=0.000）。CCK8法测得RAPA作用48 h对淋巴瘤细胞株Raji和SUDHL-4的IC50值分别为（148.198±0.007）nM与（139.866±6.812）nM;OM作用48 h对Raji和SUDHL-4细胞的IC50值分别为（0.306±0.040）μg/ml和（0.331±0.004）μg/ml。而RAPA与OM对正常淋巴细胞的IC50值分别为（608.698±20.324）nM和（2.058±0.932）μg/ml,显著高于其对淋巴瘤细胞株的IC50值（P<0.01）。2DG及RAPA分别与DOX联用均可协同抑制淋巴瘤细胞增殖;抑制细胞葡萄糖摄取及乳酸生成。研究发现RAPA对糖酵解及其联用DOX具有更加显著的抑制效果,因此后续选用RAPA作为糖酵解抑制剂与有氧氧化抑制剂OM联用,通过同时抑制糖酵解与有氧氧化的双代谢途径继而联用DOX,上述抑制作用则更加显著,此外与糖酵解及有氧氧化相关关键基因的转录、翻译以及细胞周期和细胞凋亡均被显著协同抑制。蛋白酶体抑制剂BTZ单药作用SUDHL-4及Raji细胞可显著抑制细胞增殖且呈剂量依赖性;不同程度抑制原癌基因c-MYC、HIF-1α及其下游VEGF和GLUT1、糖酵解关键酶（HKⅡ、LDHA）以及有氧氧化关键酶（SDHA）的转录与翻译;抑制葡萄糖消耗、糖酵解代谢产物乳酸及有氧氧化代谢产物琥珀酸生成;促进肿瘤细胞凋亡且呈剂量依赖性。与有氧氧化抑制剂OM联用时,以上抑制作用显著协同增强。研究结论:以HIF-1α、HKⅡ、SDHA为代表的HIF-1α-糖酵解-有氧氧化通路在初发DLBCL患者中的异常表达可预测患者预后。糖酵解抑制剂2DG、mTOR抑制剂RAPA及蛋白酶体抑制剂BTZ均有显著抑制淋巴瘤细胞糖酵解的作用,与传统化疗药DOX联用可通过下调HIF-1α从而有效抑制SUDHL-4及Raji细胞株糖酵解通路,进而发挥协同抗肿瘤作用。且在与OM作用条件下,通过对糖酵解及有氧氧化的双重抑制,其抑制细胞的能量代谢与增殖以及促进细胞凋亡的作用显著优于代谢单通路抑制,协同机制可能与联用后同时抑制糖酵解及有氧氧化两条代谢途径有关。以上均提示抑制双代谢通路可能成为治疗非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin Lymphoma,NHL）的新策略。提示HIF-1α-糖酵解-有氧氧化通路异常可能是非霍奇金淋巴瘤的重要特点,RAPA联合OM有望作为双代谢通路抑制剂成为NHL新的辅助治疗手段。