宫颈癌是全球女性癌症死亡的主要原因之一,其发病率在女性中居第二位。高危型HPV (Human papilloma virus,人乳头状瘤病毒)是导致宫颈癌发生的主要危险因素。HPV的DNA可以在超过90%的宫颈鳞癌和超过50%的宫颈腺癌中检测到。HPV是双链环状DNA病毒,高危型的HPV编码的病毒蛋白E6和E7在癌症发生发展的过程起重要作用,影响细胞周期进程和细胞凋亡的过程。尽管多价HPV预防性疫苗早已研发成功且目前已在中国大陆上市,但对于已经感染或免疫力低下的人效果有限。高危型HPV的致病机制尚未完全阐明,因此深入理解HPV的致病机制仍然是有效防治宫颈癌及其相关癌症的重要前提。为了探索高危型HPV的致病机制,本研究通过对TCGA (The Cancer Genome Atlas - Cancer Genome)公共数据库中宫颈癌样本的生物信息学分析,建立了宫颈癌高表达基因谱及相关基因启动子DNA甲基化状态分值表;通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术对E7表达的细胞与对照细胞细胞核蛋白组进行非标记定量分析,发现了E7稳定表达的细胞与对照细胞相比差异表达的蛋白组;并对TCGA数据库中宫颈癌差异表达基因数据、质谱测定E7表达细胞与对照细胞核蛋白差异表达数据,及本课题组前期的E7表达细胞与对照细胞差异表达基因的RNA-seq数据进行交叉分析,应用DAVID数据库进行GO(Gene Ontology)注释和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes )细胞通路分析,并对其上调表达的两两共有基因集应用STRING在线数据库进行了蛋白网络及信号通路分析,确定了其所富集的信号通路。上述三者的共有上调基因集,即宫颈癌中高表达且在E7表达细胞的RNA-seq数据和蛋白组数据中同时表达上调的基因/蛋白,仅包含3个,分别是CENPE、CDK1和UHRF1。对于其中的UHRF1蛋白,我们通过TCGA和GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)数据库分析了其与宫颈癌发生的相关性,并展开后续研究。通过对RNA-seq结果进一步分析,我们发现在表达HPV-16 E7的细胞和对照细胞之间,有237个基因存在显著差异表达。在这些基因中,UHRF1(编码UHRF1蛋白,也称NP95蛋白或ICBP90蛋白)在HPVE7表达细胞中表达上调,而UBE2L6(编码泛素/ISG15-结合酶E2L6,即UbcH8蛋白)表达下调。作为Ubiqutination和ISGylation中的双E2酶,UbcH8涉及细胞凋亡以及其他一些生物活性。我们利用临床宫颈癌组织样本、E7表达的细胞系和对照细胞系、及宫颈癌细胞系对UHRF1和UBE2L6在蛋白和mRNA水平的表达做了进一步验证,并发现UHRF1与基因UBE2L6的表达呈负相关,UHRF1通过对UBE2L6基因启动子甲基化表观遗传调控UBE2L6基因,从而影响其编码蛋白UbcH8的表达量。功能性研究表明UHRF1通过调控UBE2L6/UbcH8影响细胞凋亡。本研究验证了我们最近的RNA-seq结果,即UHRF1在HPV16 E7表达细胞中上调,而UbcH8下调。我们发现在宫颈癌细胞中,UHRF1通过启动子甲基化调控基因UBE2L6。此外,UHRF1和UBE2L6编码的UbcH8在细胞凋亡中的作用也得到证实。这些结果表明UBE2L6可作为介导细胞凋亡的UHRF1的新靶点。因此,我们的研究揭示了 UHRF1抑制宫颈癌细胞凋亡的机制,并为宫颈癌治疗提供了潜在的候选药物靶点。第一部分宫颈癌的生物信息学分析及UHRF1与宫颈癌的关系一、研究方法1、使用TCGA-Assembler下载TCGA数据库中子宫颈癌的相关数据:CESC(宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌)子数据库中mRNA表达数据和IlluminaInfiniumHumanMethylation450微珠芯片平台采集的DNA甲基化数据。2、用串联质谱(LC-MS/MS)非标记定量法在E7表达细胞与对照细胞中检测细胞核差异表达基因。选择实验室构建的稳定表达HPV-16E7基因的RPE1细胞(表达人端粒酶逆转录酶的人视网膜色素上皮细胞)及相应对照细胞进行核蛋白提取及差异蛋白组分析。3、对由TCGA数据库和串联质谱获得的数据进行处理分析,得到差异表达基因组,对其进行GO(Gene Ontology)注释和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes )细胞通路分析。4、交叉分析由TCGA宫颈癌表达差异数据、串联质谱E7细胞差异表达蛋白组数据、本课题组前期获得的E7细胞差异表达基因的RNA-seq数据,获得共有高表达基因集并对其进行STRING蛋白网络分析。5、通过TCGA公共数据库宫颈癌数据分析UHRF1与宫颈癌发生的相关性。二、研究结果1、通过对TCGA数据库中宫颈癌中差异表达基因的筛选及分析,我们得到2043个表达差异显著的基因,其中779个基因表达上调,而1264个基因表达下调。2、我们分别对筛选到的779个上调基因和1264个下调基因进行了功能和通路富集分析。其中GO功能富集分析显示,在生物过程子集中,上调的基因主要富集在“细胞分裂、有丝分裂核分裂”等;下调的基因主要富集在“与信号转导相关的基因、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、细胞粘附相关基因”等生物过程。在细胞组件子集中,上调的基因主要富集在“细胞质、细胞核、胞液”等;下调的基因主要富集在“质膜、胞外体胞外区”等。在分子功能子集中,上调的基因主要富集在“与蛋白结合相关的基因集、与ATP结合的相关基因集、同源蛋白结合相关基因集”等;下调的基因主要富集在“与金属离子结合的相关基因集、与钙离子结合的相关基因集、与锌离子结合的相关基因集”等。KEGG通路分析表明,上调基因主要富集在“细胞周期、癌症相关”信号通路。3、我们选取TCGA数据库中筛选出的宫颈癌显著上调基因779个与本课题组前期的RNA-seq结果中E7表达细胞显著上调基因150个取交集,得到共同的高表达基因集,共76个基因。4、通过对TCGA数据库CESC子集下载得到的随机50例宫颈癌样本数据启动子区域DNA甲基化分析,我们得到20764个基因启动子区域的平均DNA甲基化数值。使用VLOOKUP函数从上述20764个数值中抓取前50个TCGA宫颈癌差异显著表达基因所对应的启动子甲基化数值进行排序,得到在宫颈癌中高表达且启动子甲基化程度低,或低表达且启动子甲基化程度高的基因列表,列表内基因为甲基化调控候选基因。5、通过对TCGA数据库和RNA-seq数据的共有上调表达基因UHRF1与宫颈癌关联分析发现,UHRF1的基因拷贝数变异、表达量、突变等对于各癌症的影响都有一定的相关性,且影响程度不一,其中对宫颈癌的影响排在各癌症中的第4位。UHRF1高表达组的生存率低于UHRF1低表达组的生存率。6、我们利用质谱技术将E7表达细胞与对照细胞在核蛋白组范围内进行了差异表达蛋白分析。共发现有374个蛋白在E7表达细胞与对照细胞之间存在明显表达差异,其中191个蛋白在E7表达细胞中表达上调,183个蛋白在E7表达细胞中表达下调。7、基因本体(GO)和细胞通路分析(KEGG)显示,大部分E7表达细胞中表达上调的基因集中于“rRNA过程、病毒转录、转录起始和调控”等生物学过程,而E7表达细胞中的下调基因集中于“细胞黏连、mRNA剪切”等生物学过程中。通路分析也显示,E7表达细胞的上调蛋白多富集在“核糖体通路”而下调蛋白多富集于“焦点黏连”等通路。8、对差异蛋白进行通路分析发现E7表达细胞上调的核蛋白集中在“病毒进程、mRNA代谢过程”,而其在“核糖体通路、剪接体通路、帕金森氏疾病通路及亨廷顿氏疾病通路”中也有较高富集。下调的核蛋白集中在“细胞组分和蛋白复合体亚基”通路中,而其在分子功能方面,多富集于“RNA绑定、细胞骨架蛋白绑定、细胞组分募集”等通路中。9、我们对三组差异表达数据进行交叉分析,得到共有上调表达蛋白集。其中RNA-seq和质谱测定的差异蛋白组这两组数据中同时出现的上调蛋白有7个,分别为DEK、CENPE、RFC3、LBR、CDK1、CDK2、UHRF1。这7个蛋白与TCGA数据库中宫颈癌表达上调蛋白组交叉的蛋白有三个,分别是CENPE、CDK1和UHRF1。第二部分UHRF1通过表观遗传学下调UbcH8抑制宫颈癌细胞的凋亡一、研究方法1、收集宫颈癌及正常宫颈组织石蜡样本,利用免疫组织化学(IHC)技术检测已验证的高表达蛋白UHRF1及低表达蛋白UbcH8在宫颈癌及正常宫颈组织中的表达情况。2、实时定量PCR和蛋白免疫印迹分析验证质谱差异表达蛋白。3、通过在宫颈癌细胞系中转染靶向UHRF1的siRNA和表达UHRF1的质粒,检测UHRF1的敲除和过表达对于UbcH8表达的影响。4、染色质免疫沉淀(ChIP)测定UHRF1与UBE2L6(编码UbcH8)启动子的结合情况。5、通过甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐测序PCR( BSP)检测UBE2L6启动子甲基化状态。6、通过荧光双染和V-FITC / PI流式细胞术检测UHRF1及UbcH8对于细胞凋亡的影响。二、研究结果1、通过对UHRF1和UbcH8的表达通过免疫组织化学评估,UHRF1在宫颈癌组织中的表达与正常宫颈组织相比显著升高,而UbcH8在宫颈癌组织与正常宫颈组织中均有表达,其核染色在正常组织中明显增强。2、在宫颈癌细胞系HeLa细胞中敲除UHRF1,UbcH8的蛋白表达升高;过表达UHRF1下调UbcH8的表达。同样结果在乳腺癌细胞系MCF7细胞中得到了验证。3、染色质免疫沉淀(ChIP)分析证实UHRF1与UBE2L6 (编码UbcH8)启动子在两个含CCAAT的预测区域结合。表明UHRF1通过结合于UBE2L6的启动子而发挥其表观遗传学调控的作用。4、甲基化特异性PCR(MSP)表明,UBE2L6启动子在E7表达细胞中高甲基化,敲低UHRF1后,UBE2L6启动子甲基化的程度降低。在HeLa细胞中敲低UHRF1,应用BSP检测14个位点的甲基化情况,位点3-7,9和12-14的甲基化降低。表明UHRF1在子宫颈癌细胞中通过启动子甲基化表观调控UBE2L6基因。5、UHRF1通过调节UBE2L6的表达来抑制细胞凋亡。在E7表达的细胞中,敲低UHRF1后,通过V-FITC/PI测定的细胞凋亡增加。同样,作为UHRF1的靶标,UbcH8表达质粒在E7表达细胞中的转染增加了细胞凋亡。在HPV E7阳性HeLa细胞中获得了类似的结果。研究结论1、通过TCGA公共数据库分析发现了宫颈癌中的差异表达蛋白及其富集的相关信号通路,并找到了 UHRF1相关的生物过程和分子功能通路。2、建立了HPV E7表达细胞与对照细胞的差异表达蛋白组并得到差异表达蛋白富集的相关通路。3、在宫颈癌细胞中证实UHRF1和UbcH8的表达成负相关,并在临床组织样本中得到验证。4、在宫颈癌细胞中证实UHRF1通过对UBE2L6启动子的甲基化,表观遗传调控UbcH8的表达。5、发现了 UbcH8作为UHRF1的新靶点调节UHRF1的凋亡功能。研究意义与创新性1、建立了使用公共数据库和实验大数据交叉分析筛选相关基因的方法。2、获得了宫颈癌差异表达蛋白组并得到其富集的相关通路,为后期的深入研究提供思路。3、首次发现在宫颈癌细胞中UHRF1和UbcH8的表达成负相关,并在临床组织样本中得到验证,为宫颈癌的检测提供了候选靶点。4、首次在宫颈癌细胞中证实UHRF1通过对UBE2L6启动子的甲基化,表观遗传调控UBE2L6的表达,我们的研究表明UHRF1 / UbcH8有潜力应用于宫颈癌的治疗。