[研究目的]套细胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma,MCL)为非霍奇金B细胞淋巴瘤,经检测发现,在大量病人中特异性存在t(11;14)(q13;q32),并因此导致cyclinDl过度表达。套细胞淋巴瘤病发率偏低,仅为5%-10%,但其预后极差,容易复发,是中位生存期最短的淋巴瘤亚型,大约为3-5年。G9a(Euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2,也称作EHMT2)是研究比较广泛的组蛋白赖氨酸甲基化转移酶,其在多种肿瘤中出现异常表达增高,并与肿瘤增殖、凋亡、侵袭等生物学功能有关,但其在MCL中尚未有研究。本实验旨在研究G9a在MCL中表达情况及其在套细胞淋巴瘤发生发展中的作用机制。第一部分G9a在套细胞淋巴瘤中表达情况及甲基化芯片分析[方法]1.收集山东大学齐鲁医院2006年至2017年之间套细胞淋巴瘤病例及淋巴结反应性增生病例,分别收集到39例及20例病例,利用免疫组化方法检测实验组与对照组中G9a蛋白的表达。2.在实验组中选取4例G9a高表达病例,4例淋巴结反应性增生病例,使用Illumina甲基化芯片分析全基因组中基因甲基化差异,筛选具有显著甲基化差异的基因。3.通过更严格的筛选,我们选取了 3个发生显著高甲基化的抑癌基因,分别是EDNRB、GATA3及EPHA7。并通过BSP,验证芯片结果。[结果]1.在套细胞淋巴瘤中G9a表达率为69.2%(27/39),淋巴结反应性增生中G9a表达率为0%(0/20)。与淋巴结反应性增生相比,在套细胞淋巴瘤中,G9a表达明显上调,差异具有统计学意义。p<0.0012.分析甲基化芯片可知,基因甲基化异常是MCL全基因组中常见事件。除基因Body区外,异常甲基化最常发生于Promoter区和3’UTR区。根据CpG注释分类结果显示,异常甲基化多见于CpG Island和CpG shore区域。3.通过GO分析可知,异常甲基化主要与合成代谢、生长发育、跨膜转运等生物学功能相关。通过KEGG分析可知,异常甲基化富集于MAPK、PI3K-Akt、cAMP、Rapl等信号通路。4.目前通过BSP检测了 EDNRB5’UTR区芯片提示的甲基化位点,但实验组与对照组未显示出有明显的差异,其它高甲基化位点正在进一步检测中。[结论]1.与淋巴结反应性增生相比,在套细胞淋巴瘤中,G9a存在异常表达。2.在套细胞淋巴瘤中,基因异常甲基化普遍存在。异常甲基化最常见于启动子区、3’13UTR区、CpGIsland内和CpG Shore区。异常基因甲基化主要与合成代谢、跨膜转运等功能相关,并且主要富集于MAPK、PI3K-Akt等信号通路。第二部分G9a特异性抑制剂BIX01294对MCL细胞系组蛋白甲基化情况及对肿瘤细胞相关功能影响。[方法]1.按药物浓度梯度0、1、2、4、6μmol/l作用于Mino细胞,48h后提取蛋白,利用 western blot 检测 G9a 蛋白表达及 H3K9me2、H3K9me3、H3K4me2 及H3K27me2甲基化情况。2.利用CCK8方法检测用药后对Mino细胞增殖的影响并绘制细胞生长曲线。3.经周期检测试剂盒处理后,使用流式细胞技术,检测细胞周期情况。4.利用Western blot检测不同浓度梯度下CyclinD1、CDK4、P21蛋白表达情况。5.AnnexinV-FITC/PI双染细胞后,利用流式细胞技术,检测用药后对细胞凋亡的改变。6.利用Western blot检测不同药物浓度梯度下细胞凋亡蛋白BAX、caspase-3蛋白表达情况。[结果]1.药物作用后,随着药物浓度的改变,G9a蛋白表达无明显改变,说明药物只影响G9a活性。而随着药物浓度升高,H3K9me2、H3K27me2甲基化水平随着药物浓度增高而降低,H3K4me2甲基化水平逐渐升高,而H3K9me3甲基化水平没有明显改变。2.细胞生长曲线结果显示,在作用24h后细胞增殖能力出现明显下降,并且随着药物浓度的升高,抑制增殖的趋势越明显。3.药物作用48h后,流式结果显示G1期细胞增多,S期细胞减少,并且随着药物浓度的增加,被阻滞于G1期的细胞增多。Western blot结果显示,随着药物浓度增加,cyclinD1、CDK4和P21蛋白表达逐渐降低。4.药物作用48后,在0、1、2、4、6μmol/l药物浓度下,细胞凋亡率分别为8.9%、11.2%、14.3%、26.1%和 76.6%,差异具有统计学意义。(P<0.05)Western blot结果表明,随着药物浓度增加,凋亡蛋白BAX和capase-3表达逐渐增多。[结论]1.BIX01294可抑制G9a活性但对其表达没有影响。加药后可降低H3K9me2、H3K27me2甲基化水平,H3K4me2甲基化水平升高,对H3K9me3甲基化水平无影响。2.BIX01294可抑制细胞增殖,并与药物浓度和作用时间呈正相关。BIX01294可通过抑制cyclinD1、CDK4表达而影响细胞G1/S期的转化,将细胞阻滞于G1期,并且可通过上调BAX及caspase-3蛋白发挥促进细胞凋亡的作用。第三部分寻找G9a相互作用蛋白及相关下游靶基因研究[方法]1.通过CO-IP实验,寻找与G9a相互作用的蛋白。2.设计并合成针对G9a基因的ShRNA,以脂质体为介导转染子宫颈癌细胞株Hela细胞。3.转染48及72h后收集细胞,提取RNA及蛋白质,利用RT-qPCR及western blot检测mRNA水平及蛋白质表达水平,检测G9a干扰效率,选取干扰效率最好的一条ShRNA。4.根据干扰情况,挑选ShRNA序列,合成病毒LV-G9a-RNAi,转染套细胞淋巴瘤细胞系Jeko-1细胞,通过RT-PCR检测mRNA水平,验证转染效率。5.当转染效率达到50%以上时,通过基因表达谱芯片,筛选干扰后,表达有显著差异的基因。[结果]1.CO-IP结果显示在MCL中G9a可与HDAC1、HDAC2、UHRF1蛋白相互结合形成复合体,作用于下游靶基因,但与HDAC3未有结合。2.表达谱芯片结果显示,敲低G9a后,与NC组相比,共有611个基因发生改变,其中有266个基因表达上调,345个基因被抑制。干扰后,有多条与癌症相关的信号通路被抑制,其中对Tec激酶信号通路抑制作用最强,具体作用机制尚待进一步研究。[结论]1.在MCL中,G9a会与UHRF1及多种组蛋白去乙酰化酶结合共同发挥作用。2.干扰掉G9a后会影响多种基因表达,并影响相关信号通路。