【摘 要】
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DNA片段是一种重要的调控因子,与基因组序列相同的DNA片段可抑制细胞内特异序列的基因表达,即DNA干扰(DNAi)。目前对DNAi的研究还比较少,特别是在昆虫上的研究,暂未发现。因此,本研究以小菜蛾为研究对象,以其鞣化激素α亚基(Bursα)为靶标基因,研究小菜蛾体内是否也存在DNAi现象。根据PxBursα的序列,在外显子和内含子的不同区域各自设计7条长度为24nt的单链DNA(ssDNA)片
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DNA片段是一种重要的调控因子,与基因组序列相同的DNA片段可抑制细胞内特异序列的基因表达,即DNA干扰(DNAi)。目前对DNAi的研究还比较少,特别是在昆虫上的研究,暂未发现。因此,本研究以小菜蛾为研究对象,以其鞣化激素α亚基(Bursα)为靶标基因,研究小菜蛾体内是否也存在DNAi现象。根据PxBursα的序列,在外显子和内含子的不同区域各自设计7条长度为24nt的单链DNA(ssDNA)片段,分别将其注射入小菜蛾四龄幼虫的体内。结果发现,设计的14条序列中,有2条外显子和4条内含子处理组的小菜蛾蛹的死亡率显著高于对照组,且基因的表达量显著低于对照组,其中在外显子处理组中,E2-5处理组的干扰效果最好,蛹的致死率达到38.3%,而内含子以11-2处理组的干扰效果最好,蛹的致死率达到36.9%。延长或缩短ssDNA的长度,发现当外显子长度缩短至12nt时干扰效率显著降低,蛹死亡率仅为15.9%,随着序列的延长,效率不断提高,以35nt最高达到45%,;当内含子片段缩短至18nt和12nt时,干扰效率显著降低,但两组蛹的死亡率无显著差异,延长其片段长度并未提高干扰效率。比较ssDNA(E2-5)、dsDNA、和dsRNA的干扰效果,发现干扰效果最好的是dsDNA,死亡率达到52%。PCR分别扩增并纯化小菜蛾Bursα第二段外显子和第二段内含子上约120bp长度的序列,将其稀释成100ng/μL、170ng/μL、280ng/μL和400ng/μL四个浓度,注射入小菜蛾四龄幼虫体内,观察小菜蛾的死亡情况。实验结果表明,100ng/μL处理组的蛹死亡率较低,低于20%,随着浓度的升高,死亡率不断上升,400ng/μL处理组的蛹死亡率到达50%以上,但中间两个浓度处理组无显著差异。RT-qPCR结果显示,相关处理组的Bursα表达量均明显降低。综上所述,导入外显子和内含子DNA片段均能导致小菜蛾蛹的死亡和靶标基因表达的抑制,首次证明了昆虫体内也存在DNAi的现象,并明确了昆虫DNAi的特征,填补了昆虫DNAi研究的空白。
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