研究背景众所周知,机体内的消化系统和造血系统对辐射最为敏感。临床上,许多接受辐射治疗的癌症患者常伴随急性和慢性肠道及骨髓损伤,这限制了癌症的成功治疗;在核意外事故或核恐怖袭击条件下,最先损伤的系统也是消化系统和造血系统,出现急性放射综合征。虽然已有缓解辐射导致的急性造血系统损伤药物如氨磷汀(Amifostine)和优保津(Filgrastim)等在临床应用,但目前尚没有公认的能有效缓解辐射导致的急性肠道损伤药物,其主要原因是人们对辐射导致肠道损伤机制的研究不够深入,因此有必要通过了解其机制寻找新的防治方法。mTORC1信号通路作为细胞内多条通路的枢纽,参与多种重要生理病理过程,如胰岛素/胰岛素受体通路、PI3K/Akt通路和AMPK通路等。但在辐射条件下,肠黏膜上皮细胞内mTORC1信号通路是否参与辐射导致的肠道损伤?改变mTORC1信号通路状态能否保护或修复肠道的辐射损伤等问题,值得深入探讨。本文通过观察不同剂量X射线全身辐射后小鼠的生存情况和肠黏膜病理变化程度以确定后续实验的辐射剂量(第一部分);系统观察了X射线全身辐射小鼠小肠隐窝细胞mTORC1信号通路及与此相关的细胞自噬、细胞凋亡、NF-κB信号通路和DNA损伤等病理生理变化以了解mTORC1信号通路在此过程中的作用(第二部分);应用雷帕霉素短暂抑制辐射激活的mTORC1信号通路,观察其对小鼠存活、肠黏膜机械屏障及肠道干细胞损伤等的影响以进一步证实mTORC1信号通路的作用和作为干预药物的防护效果(第三部分);并从细胞自噬、细胞凋亡、NF-κB信号通路和DNA损伤修复等方面深入研究雷帕霉素抑制mTORC1信号通路对肠黏膜辐射损伤保护作用的机制(第四部分)。第一部分不同剂量X射线辐射致小鼠肠黏膜损伤目的:以X射线全身辐射建立小鼠辐射模型,观察辐射对小鼠肠黏膜机械屏障和肠道干细胞的损伤。方法:120只8周C57BL/6雄性小鼠随机分为4 Gy组、8 Gy组、12 Gy组和正常对照组共4组。小鼠采用Elekta Precise直线加速器进行X射线全身一次性辐射建模,辐射总剂量分别为4 Gy、8 Gy和12 Gy,辐射速率为2.28 Gy/min。正常对照组不辐射。40只用于观察各组小鼠30天内生存情况;80只建模后取材,辐射小鼠各组观察时间点为6h,1d,2d,3d和7d。采用速率法检测血清DAO活性观察肠道通透性变化,苏木素-伊红(H-E)染色法观察各组小鼠空、回肠组织病理变化,透射电镜观察空肠黏膜上皮细胞超微结构变化,免疫组织化学染色观察Olfm4~+肠道干细胞、Lysozyme~+潘氏细胞和紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin的分布及变化,PAS染色观察杯状细胞变化,嗜银染色观察小肠嗜银细胞变化,蛋白免疫印迹法检测ZO-1、Occludin蛋白表达变化。结果:1.随着X射线辐射剂量增加,小鼠体重降低;辐射后30天内生存率观察,辐射剂量越大,小鼠存活时间越短。12 Gy组小鼠5天内全死亡,8 Gy组14天内全部死亡,4 Gy组小鼠全部存活;2.不同剂量X射线辐射后,空肠和回肠肠绒毛出现倒伏、缩短和上皮脱落以及固有层毛细血管扩张出血等病理变化,肠上皮细胞微绒毛和细胞内线粒体等细胞器超微结构有损伤,其中12 Gy辐射损伤最严重;不同剂量辐射后空肠、回肠损伤分数均升高,且辐射剂量越大升高越明显。辐射后回肠的损伤分数变化与空肠相似,但比空肠轻。3.不同剂量X射线辐射可导致DAO活性增强,与正常对照组相比,8 Gy组和12 Gy组变化均有统计学意义(P<0.01)。4.X射线辐射均导致空肠、回肠Olfm4阳性细胞数量减少,但不同剂量的作用差异很大。4 Gy、8 Gy辐射后阳性细胞数减少后快速回升,12 Gy辐射后则持续减少。5.X射线辐射可导致空肠、回肠肠绒毛杯状细胞、嗜银细胞数量减少。与正常组相比,4 Gy组各时间点差异无统计学意义,8 Gy辐射后细胞数减少后回升,12 Gy组则持续减少(P<0.01或P<0.05)。不同剂量X射线辐射后空肠潘氏细胞数量出现先增加后减少的的变化趋势,回肠潘氏细胞数在4 Gy辐射后变化不明显,但8 Gy和12Gy辐射后阳性细胞数减少。6.通过观察8 Gy X射线辐射后肠黏膜ZO-1和Occludin蛋白,各时间点均表达降低且分布异常(P<0.01)。结论:不同剂量X射线辐射均可不同程度损伤空肠、回肠肠黏膜,破坏肠黏膜机械屏障,而且造成肠道干细胞的数量减少和分化异常。第二部分mTORC1信号通路在辐射致小鼠肠黏膜损伤中的作用目的:以X射线全身辐射建立小鼠辐射模型,观察辐射对小鼠空肠隐窝细胞mTORC1信号通路、NF-κB信号通路和DNA损伤情况,探讨mTORC1信号通路在辐射肠黏膜损伤中的作用。方法:85只8周C57BL/6雄性小鼠随机分4 Gy组、8 Gy组、12 Gy组和正常对照组共四组。采用Elekta Precise直线加速器对小鼠进行X射线全身一次性辐射,建立小鼠辐射模型,辐射总剂量分别为4 Gy、8 Gy和12 Gy,辐射速率为2.28 Gy/min,辐射组小鼠观察时间点为6h,1d,2d,3d和7d,其中8 Gy增加12h观察时间点,正常对照组不辐射。各组小鼠处死前两小时腹腔注射Brd U溶液(100mg/kg),麻醉后留取空肠标本。采用免疫组织化学法观察肠隐窝pS6表达变化、Brd U~+增殖细胞数量变化、细胞核内γH2AX和53BP1阳性焦点数变化,免疫荧光双重染色观察Olfm4~+小肠干细胞内pS6表达变化,TUNEL法观察肠隐窝凋亡细胞变化,蛋白免疫印迹法检测S6、pS6、mTOR、pmTOR、LC3B、p62、Akt、pAkt、p65和pp65蛋白表达变化。结果:1.不同剂量X射线全身辐射小鼠后空肠肠隐窝pS6免疫阳性蛋白积分光密度值明显高于正常组,蛋白印迹检测也显示8 Gy肠隐窝pS6、pmTOR蛋白高表达(P<0.01);辐射后pS6和Olfm4阳性染色共同表达于同一肠道干细胞,肠隐窝细胞(包括肠道干细胞)内mTORC1信号通路被激活。2.不同剂量X线辐射均导致空肠Brd U~+增殖细胞数量减少,但不同剂量的作用差异较大。4 Gy和8Gy组辐射后阳性细胞呈现降低-升高-恢复正常的变化规律,12 Gy组则持续减少(P<0.01)。不同剂量辐射后肠隐窝凋亡细胞数明显比正常组多(P<0.01或P<0.05)。3.8 Gy辐射后肠隐窝内p62表达均高于正常对照组(P<0.01),LC3BII/LC3BI的比值较未辐射组显著降低(P<0.01或P<0.05);辐射后细胞自噬受到显著抑制。4.与正常对照组比,8 Gy辐射后肠隐窝pAkt蛋白表达水平升高;辐射后肠隐窝pp65蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。5.8 Gy辐射后小鼠肠隐窝细胞核内γH2AX和53BP1焦点数明显高于未辐射小鼠肠隐窝细胞(P<0.01)。结论:辐射后肠隐窝细胞内mTORC1信号通路和NF-κB信号通路过度激活,细胞自噬受抑制,辐射引起肠道隐窝细胞DNA损伤和细胞凋亡。第三部分雷帕霉素对辐射致小鼠肠黏膜损伤的保护作用目的:以X射线全身辐射小鼠构建辐射模型,探索雷帕霉素通过抑制mTORC1信号通路,对辐射肠黏膜损伤的保护作用。方法:90只8周C57BL/6雄性小鼠随机分为正常对照组,单纯辐射组,雷帕霉素处理组和雷帕霉素对照组,40只用于观察小鼠30天内生存率,50只按实验需要处理小鼠并取材,采用Elekta Precise直线加速器对小鼠进行8 Gy X射线全身一次性辐射,雷帕霉素处理组全身辐射后6h给小鼠皮下注射雷帕霉素(4mg/kg),以后隔天注射1次,雷帕霉素对照组小鼠不辐射但同时间点给药,单纯辐射组和正常对照组不给药,观察时间点为辐射后1d,3d,7d。各组小鼠麻醉后留取空肠标本,采用速率法检测血清DAO活性观察肠道通透性变化,H-E染色法观察各组小鼠空肠组织病理变化,透射电镜观察空肠黏膜上皮细胞超微结构变化,免疫组织化学观察Olfm4~+肠道干细胞、Lysozyme~+潘氏细胞,pS6,紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin的分布及变化,免疫荧光双重染色观察Olfm4~+小肠干细胞内pS6表达变化,PAS染色观察杯状细胞变化,嗜银染色观察嗜银细胞变化,蛋白免疫印迹法检测ZO-1、Occludin、S6、pS6、mTOR、pmTOR蛋白表达变化。结果:1.雷帕霉素处理后能显著降低由辐射导致的肠隐窝pS6、pmTOR蛋白高表达(P<0.01),并可明显减弱肠隐窝和肠道干细胞辐射后增强的pS6荧光强度,能有效抑制辐射导致的肠隐窝细胞包括肠道干细胞内的mTORC1信号通路。2.雷帕霉素处理组在辐射后30天仍有30%的小鼠存活,而单纯辐射组小鼠全部死亡,雷帕霉素处理后可提高辐射小鼠生存率(P<0.05)。3.与单纯辐射组相比,雷帕霉素处理后小鼠血清DAO活性明显降低(P<0.05);空肠黏膜的病理变化明显改善,肠绒毛增高,肠黏膜上皮细胞损伤减轻,微绒毛的形态和数量得到改善,紧密连接结构趋于正常,损伤分数显著降低(P<0.01)。4.与单纯辐射组比,雷帕霉素处理后辐射小鼠空肠肠黏膜ZO-1和Occludin蛋白表达升高(P<0.01),在肠黏膜上皮细胞间的分布增加,结构也更清晰。5.雷帕霉素处理组1天和3天Olfm4~+细胞数量比辐射组少,但辐射后7天肠隐窝内肠道干细胞的数量多于辐射组(P<0.01);辐射后,雷帕霉素处理可增加肠黏膜杯状细胞和潘氏细胞数量(P<0.01)。雷帕霉素处理促进了肠道干细胞数量及细胞分化功能的恢复。结论:短暂使用雷帕霉素可抑制辐射激活的mTORC1信号通路,促进肠道干细胞的恢复以及肠黏膜损伤的修复。第四部分雷帕霉素对辐射致小鼠肠黏膜损伤的保护机制目的:以X射线全身辐射小鼠为模型,探索雷帕霉素对辐射损伤肠黏膜保护作用的机制。方法:65只8周C57BL/6雄性小鼠随机分为正常对照组,单纯辐射组,雷帕霉素处理组和雷帕霉素对照组,采用Elekta Precise直线加速器对小鼠进行8Gy X射线全身一次性辐射,雷帕霉素处理组全身辐射后6h给小鼠皮下注射雷帕霉素(4mg/kg),以后隔天注射1次,雷帕霉素对照组小鼠不辐射但同时间点给药,单纯辐射组和正常对照组不给药,观察时间点为辐射后12h,1d,3d,7d。各组小鼠处死前两小时腹腔注射Brd U溶液(100mg/kg),麻醉后留取空肠标本。采用免疫组织化学法观察肠隐窝Brd U~+增殖细胞数量变化、细胞核内γH2AX和53BP1阳性焦点数变化,TUNEL法观察肠隐窝凋亡细胞变化,qRT-PCR法检测肠隐窝Puma、Bcl2、Bcl-xl、Bax和Bak基因表达量的变化,蛋白免疫印迹法检测LC3B、p62、Akt、pAkt、p65和pp65蛋白表达变化。结果:1.单纯辐射组LC3BII的表达量低于LC3BI量,而雷帕霉素处理后LC3BII的表达量高于LC3BI,LC3BII/LC3BI的比值比单纯辐射组高(P<0.01)。单纯辐射组肠隐窝p62的表达明显比正常对照组高,而雷帕霉素能显著降低辐射导致的p62表达升高(P<0.01)。雷帕霉素处理组肠隐窝pAkt、pp65表达较单纯辐射组均明显减少(P<0.01或P<0.05)。2.雷帕霉素处理后小鼠肠隐窝内Brd U~+细胞数较单纯辐射组明显减少,雷帕霉素能有效抑制辐射后肠隐窝细胞的过度增殖(P<0.01),雷帕霉素处理后肠隐窝凋亡细胞数量也减少(P<0.05)。与正常对照组相比,单纯辐射后肠隐窝内表达高水平的促凋亡相关基因Puma和Bak m RNA,雷帕霉素处理能显著降低辐射后Puma和Bak m RNA的表达量(P<0.01或P<0.05)。3.雷帕霉素处理后肠隐窝细胞内γH2AX和53BP1焦点数较单纯辐射组明显减少(P<0.01),雷帕霉素减少了辐射后肠隐窝细胞的DNA损伤。结论:mTORC1信号通路抑制剂雷帕霉素通过促进细胞自噬,抑制细胞过度增殖和凋亡,抑制激活的Akt、NF-κB信号通路,促进DNA损伤修复,以达到对辐射损伤肠黏膜的保护作用。全文结论综合以上四部分内容,全文结论如下:1.X射线全身辐射可造成实验小鼠肠黏膜病理损伤,机械屏障受损,通透性增加,肠道干细胞数量减少与分化能力下降。2.X射线全身辐射激活肠隐窝上皮mTORC1信号通路,抑制细胞自噬,激活Akt和NF-κB信号通路,加速DNA损伤和细胞凋亡产生病理变化。3.雷帕霉素通过短暂抑制X射线辐射导致的肠隐窝干细胞mTORC1信号通路激活,恢复肠道干细胞数量和分化能力,维持肠黏膜机械屏障结构的完整性,提高辐射小鼠的生存率。4.mTORC1信号通路抑制剂雷帕霉素通过促进细胞自噬,抑制激活的Akt、NF-κB信号通路和细胞凋亡,促进DNA损伤修复,以达到对辐射损伤肠黏膜的保护作用。