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1型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus, T1DM）又称胰岛素依赖型糖尿病,是由T淋巴细胞介导的,以胰岛β细胞损伤为主要特征的器官特异性自身免疫病。CD8+细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs）在T1DM病程中有着重要作用,是胰岛β细胞的直接破坏者,对T1DM的发生和发展不可或缺。与其他自身免疫病一样,T1DM病程中存在表位扩展的现象,胰岛素（insulin, Ins）作为目前公认的启动抗原,对于其他自身抗原的暴露及相应CTLs的诱导有着关键作用。在常用的T1DM动物模型——非肥胖型糖尿病（nonobese diabetic, NOD）小鼠中,胰岛素抗原中主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC） I限制性的优势表位是insulin B15-23 （LYLVCGERG,简写为InsB 15-23）,由MHC I类分子H-2Kd递呈。本文旨在制备检测InsB 15-23特异性CTLs的工具并探究InsB 15-23特异性CTLs在T1DM病程中的作用。目前CTLs直接检测常用以四聚体（tetramer）技术为代表的MHC Ⅰ多聚体（multimer）技术,但需要先将原核表达的MHC Ⅰ类分子、β2微球蛋白（β2-microglobulin, β2m）与抗原肽体外稀释复性成MHC Ⅰ：肽（pMHC I）复合物,再将数个pMHC I单体多聚化,所以对抗原肽与MHCⅠ类分子的亲和力要求较高,低亲和力抗原肽难以制备出稳定的pMHC I单体,多聚体就更无从谈起。天然InsB 15-23肽第九位甘氨酸残基侧链过小,导致其与H-2Kd的亲和力很弱,使我们在研究工具上遇到了障碍。目前常用的解决办法是将InsB 15-23肽第九位的甘氨酸突变为侧链更大的缬氨酸（G9V突变）,以增强抗原肽与H-2Kd抗原结合槽的锚定能力。但有报道表明改造肽制备的多聚体的识别谱可能与天然肽有差异。为了寻求在不影响特异性的前提下提高天然InsB 15-23肽与H-2Kd的亲和力的方法,本研究采用了二硫键捕获型单链三聚体（disulfide-trap single-chain trimer, dtSCT）技术。dtSCT技术是将抗原肽、β2m和MHC I类分子以柔性接头（linker, L）依次连接,并在抗原肽的C末端与MHC I类分子间引入了二硫键,将抗原肽“卡”在抗原结合槽中。这样整个融合分子的稳定性大大提高,并能获得类似天然pMHC I复合物的构象和生物学功能。但是dtSCT分子中抗原肽C端共价结合的linker1的存在会迫使抗原肽最后一位氨基酸残基旋转90度,从而降低抗原肽与MHC I类分子的亲和力,这称为“C端凸出”。dtSCT分子的稳定性受抗原肽共价结合和“C端凸出”两方面影响,最终的净效应仍然与抗原肽与MHC I类分子的亲和力相关。目前已有多篇报道说明dtSCT技术对于病毒或细菌来源的亲和力较高的抗原肽效果很好,能够使dtSCT分子中的抗原肽对外源性肽竞争性取代的抵抗力比传统四聚体分子强1000倍。为了系统地检验dtSCT技术对InsB15-23肽这样的低亲和力肽是否适用,本研究构建了四种可溶性dtSCT （soluble dtSCT,简写为sdtSCT）单体分子用于四聚体制备,分别是 InsB15-23 sdtSCT、InsBG9v sdtSCT、InsBQ115E sdtSCT以及InsBG9Vv/Q115E sdtSCT,其中Q115E突变的引入是为了增强MHC I类分子与CD8分子的亲和力。研究证实,四种sdtSCT单体很稳定,并且制成的四聚体的非特异性标记水平都很低,对阴性对照小鼠BALB/c小鼠的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）的非特异性标记水平分别为0%、0.06%、0.02%和0.07%,脾脏淋巴细胞非特异性标记水平分别为0.01%、0.03%、0.04%和0.05%；而商品化G9V传统五聚体对BALB/c小鼠的PBMC和脾脏淋巴细胞的非特异性标记水平分别为0.07%和0.04%。可见自制的四种四聚体与商品化传统五聚体的非特异性标记水平基本相当。另一方面,自制的四种四聚体都能检测出4周龄NOD雌鼠PBMC中低水平的InsB 15-23特异性CTLs,分别为0.29%、0.69%、0.89%和1.03%,对脾脏淋巴细胞的检测结果分别是0.03%、0.03%、0.15%和0.20%；商品化G9V传统五聚体对4周龄NOD雌鼠PBMC和脾脏淋巴细胞中InsB 15-23特异性CTLs的检出率分别为0.46%和0.09%。四种自制四聚体中,至少sdtSCT和InsBG9V/O115E sdtSCT四聚体对4周龄NOD雌鼠体内低水平InsB1 5-23特异性CTLs的检出率高于商品化传统五聚体。这样就从原核表达水平证明了即使是亲和力这么弱的InsB 15-23肽,dtSCT分子中肽共价结合的优势足以弥补“C端凸出”的影响,使sdtSCT型四聚体具有比商品化G9V传统五聚体更好的表现,说明dtSCT技术很可能是解决低亲和力抗原肽多聚体制备难题的一个好方法。由于Q115E突变不会引起四聚体识别谱的改变,且InsBQ115E sdtSCT四聚体的检出率又仅次于InsBG9V/Q115E sdtSCT,高于商品化G9V传统五聚体,所以本研究又构建了InsBQ115E的膜表达型dtSCT分子（membrane-expressed dtSCT,简写为mdtSCT）。将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1（-）,皮下免疫NOD小鼠,观察其体内诱生InsB 15-23特异性CTLs的能力,结果发现,InsBQ115E mdtSCT真核表达载体确实能在NOD小鼠的外周血和脾脏中诱生出更多InsB 15-23特异性CTLs。三次免疫后,mdtSCT免疫组NOD小鼠的外周血中InsB15-23特异性CD8+T细胞频率为1.93±0.55%,与空质粒对照（0.22±0.11%）有极显著差异（p<0.01）；脾脏中InsB15-23特异性CD8+T细胞频率为0.83±0.31%,与空质粒对照（0.37±0.20%）亦有极显著差异（p<0.01）。这样我们又从真核表达水平对dtSCT分子的生物学功能进行了验证。最后,本研究还用InsBQ115E mdtSCT对3周龄NOD雌鼠进行了免疫干预,发现InsBQ115E mdtSCT分子能减轻NOD小鼠胰岛单个核细胞的浸润程度,并对NOD小鼠T1DM具有免疫保护作用,30周龄时NOD小鼠的发病率仅为9%,而空质粒对照组的发病率为60%。并且还发现这种免疫保护作用是IGRP非依赖性的。综上所述,本研究通过引入MHC I类分子的dtSCT技术,成功制备出传统多聚体技术无法制备的低亲和力表位肽InsB15-23的四聚体,并经过了功能验证,证明了dtSCT技术在低亲和力表位肽的MHC I多聚体制备方面具有独特优势。本研究成功利用InsBQ115E mdtSCT对低周龄NOD小鼠进行免疫干预,显著降低了NOD小鼠T1DM的发病率,为T1DM的治疗提供了一种有希望的、安全型更好的特异性免疫新疗法。但InsBQ115E mdtSCT对NOD小鼠T1DM免疫保护作用的详细机制还有待更加深入的研究。