目的:非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是指在无过量饮酒史的情况下,患者肝脏组织学的改变类似于酒精性肝病的临床病理综合征,主要病理表现特征为肝实质细胞内脂肪过度沉积和炎症。NASH是一种在世界范围内发病率极高的慢性代谢综合征,其发病进程与肝脏的脂堆积、胰岛素抵抗和氧化应激紊乱有密切的关系。目前关于NASH的发病机制还研究的不是很清楚,临床上也没有获批上市可以治疗NASH的药物,关于NASH的治疗主要从单方面的降脂、调节胰岛素抵抗、抗氧化、抗炎等方面进行,效果并不理想。含有Caspase-8和Fas相关死亡结构域样凋亡调节因子(CFLAR)是天然免疫调控分子中的一员,最新的研究表明CFLAR可以通过抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化,进而调节JNK下游的基因和蛋白的表达,调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗和氧化应激紊乱,逆转整个NASH的进程。水飞蓟宾是从菊科植物水飞蓟Silybum marianum(L.)Gaertn的果实和种子中分离出来的一种黄酮木脂素,是一种具有较高安全性的护肝药物,具有多种药理活性,包括抗氧化、抗癌、调节糖脂代谢、提高细胞膜的稳定性等。已有的关于水飞蓟宾与NASH的研究表明,水飞蓟宾可通过调节IRS1-PI3K-AKT通路,改善高脂饲料诱导的SD大鼠肝脏及棕榈酸(PA)诱导的BRL3A细胞和HepG2细胞中的脂代谢紊乱及胰岛素抵抗;通过抑制核因子κB(NF-κB)活性,改善蛋氨酸-胆碱缺乏饲料(MCD)诱导的db/db小鼠肝脏硝化应激紊乱;通过修复线粒体的功能,改善MCD诱导的Wistar大鼠肝脏的氧化应激损伤;在临床上水飞蓟宾与维生素E合用,可以改善NASH患者的肝组织学病变。目前关于水飞蓟宾对NASH状态下肝脏CFLAR-JNK通路的影响尚不清楚。本文的目的在于研究水飞蓟宾对NASH模型中对肝细胞CFLAR-JNK通路及其下游脂代谢、胰岛素抵抗和氧化应激关键调节因子的表达的影响。方法:(1)在体内用MCD饮食喂食C57BL/6小鼠并同时灌胃水飞蓟宾(10 mg/kg/day,20 mg/kg/day)6周建立NASH模型。处理完成后,首先制作肝小叶的病理学切片,进行油红O染色、H&E染色和MT染色,对肝脏的脂堆积、空泡、炎症和纤维化的病变程度做一个分析。然后检测生化指标,包括代表小鼠肝损伤程度的血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量,代表肝脂堆积程度的肝匀浆中总胆固醇(TC)和总甘油三酯(TG)的含量,代表肝氧化损伤程度的肝匀浆中的丙二醛(MDA)含量,氧自由基清除酶过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、血红素氧化酶(HO-1)的活性,氧自由基生成酶细胞色素P450酶2E1(CYP 2E1)和细胞色素P450酶4A(CYP 4A)的活性,通过RT-q PCR检测了肝组织中与脂质β氧化相关的过氧化物酶体增殖物激活受体α(Pparα)、脂肪酸结合蛋白5(Fabp5)、肉碱棕榈酰转移酶1α(Cpt1α)、酰基辅酶A氧化酶(Acox),与脂质转运出肝脏相关的硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Scd-1)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(Gpat)、微粒体甘油三酯转运蛋白(Mttp),与脂质从头合成途径相关的固醇调节元件结合蛋白1C(Srebp-1c)、马铃薯糖蛋白样磷酯酶结构域蛋白3(Pnpla3)的mRNA相对表达量,并通过Western blot检测了CFLAR、磷酸化C-Jun氨基末端激酶(p JNK)、JNK、核因子相关因子2(NRF2)、CYP 2E1、CYP 4A的蛋白相对表达量。(2)在体外用0.5 mM油酸(OA)处理人肝癌细胞系HepG2细胞24 h建模,然后用水飞蓟宾(5μM、20μM、50μM、100μM)处理细胞24h,检测胞内的TG含量、活性氧(ROS)含量、一氧化氮(NO)含量和2-NBDG的摄取能力,通过RT-q PCR检测了细胞中PNPLA3、SREBP-1C、PPARα的mRNA的表达量的变化,并通过Western blot检测了细胞中的CFLAR、p JNK及其下游关键蛋白的表达量,包括与脂代谢相关的PNPLA3、SREBP-1C、PPARα,与胰岛素抵抗相关的磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)、磷酸化丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(p AKT),与氧化应激相关的NRF2、CYP 2E1、CYP 4A。(3)在体外用0.25 mM PA和0.5 mM OA的混合物处理小鼠正常的肝细胞系NCTC-1469细胞24 h建模,然后用水飞蓟宾(50μM、100μM)处理细胞24 h,做一个油红O爬片分析,检测胞内的TG含量和2-NBDG的摄取能力,通过Western blot检测了细胞中的CFLAR、p JNK及其下游关键蛋白的表达量,包括与胰岛素抵抗相关的磷酸化胰岛素受体底物1(p IRS1),与氧化应激相关的NRF2。(4)在体外用可以沉默Cflar的腺病毒Ad-sh Cflar处理NCTC-1469细胞24 h建模,然后用水飞蓟宾(50μM、100μM)处理细胞24 h,首先通过RT-q PCR检测病毒和水飞蓟宾对Cflar的mRNA的表达量的影响,然后通过Western blot检测了细胞中的CFLAR、p JNK及其下游关键蛋白的表达量,包括与胰岛素抵抗相关的p IRS1,与氧化应激相关的NRF2。结果:(1)在MCD饮食诱导的C57BL/6小鼠中,组织学切片的结果显示,模型组的小鼠相对于空白对照组,肝组织的脂质堆积明显增加,炎症和空泡也明显多于正常组;水飞蓟宾处理组可以剂量依赖性的降低胞内的脂质含量、炎症和空泡。生化检测的结果显示,MCD饮食喂食的小鼠血清中的ALT、AST活性增加,肝组织匀浆中TG、TC、MDA的含量增加;水飞蓟宾可以剂量依赖性的降低血清中ALT、AST的活性和肝匀浆中TG、TC、MDA的含量。氧化应激相关酶系的活性检测结果显示,MCD饮食处理的小鼠肝匀浆中CAT、GSH-Px、HO-1的酶活被抑制,而CYP 2E1和CYP 4A的酶活被促进;水飞蓟宾可以剂量依赖性的升高CAT、GSH-Px、HO-1的活性,抑制CYP 2E1和CYP 4A的活性。RT-q PCR的结果显示,MCD饮食处理的小鼠,其肝匀浆中Pparα、Fabp5、Cpt1α、Acox、Scd-1、Gpat、Mttp的mRNA表达量被抑制了,Srebp-1c、Pnpla3的mRNA表达量没有改变;水飞蓟宾可以剂量依赖性的上调Pparα、Fabp5、Cpt1α、Acox、Scd-1、Gpat、Mttp的mRNA表达量,对Srebp-1c、Pnpla3的mRNA表达量没有明显影响。Western blot的结果显示,MCD饮食会抑制肝组织中CFLAR、NRF2的蛋白表达量,促进CYP 2E1、CYP 4A和p JNK的蛋白表达;水飞蓟宾可以剂量依赖性的升高CFLAR、NRF2的蛋白表达量,抑制CYP 2E1、CYP 4A和p JNK的蛋白表达。(2)在OA诱导的HepG2细胞中,相对于空白对照组,OA处理组的TG含量、ROS含量、NO含量都是显著性的升高的,细胞对2-NBDG的摄取能力被抑制;水飞蓟宾可以浓度依赖性的降低胞内的TG含量、NO含量,提高细胞对2-NBDG的摄取能力。RT-q PCR的结果显示,OA处理组的PNPLA3、SREBP-1C的mRNA表达量被上调,PPARα的mRNA表达量被下调,PPARα/SREBP-1C的比值降低;水飞蓟宾可以浓度依赖性的下调PNPLA3、SREBP-1C的mRNA表达量,上调PPARα的mRNA表达量,升高PPARα/SREBP-1C的比值。Western blot的结果显示,OA处理组的p JNK、PNPLA3、SREBP-1C、CYP 2E1、CYP 4A的蛋白表达量被上调,CFLAR、PPARα、PI3K、p AKT、NRF2的蛋白表达量被下调;水飞蓟宾可以浓度依赖性的下调p JNK、PNPLA3、SREBP-1C、CYP 2E1、CYP 4A的蛋白表达量,上调CFLAR、PPARα、PI3K、p AKT、NRF2的蛋白表达量。(3)在PA和OA诱导的NCTC-1469细胞中,相对于空白对照组,油红O的结果显示,模型组细胞内脂滴的含量明显增加,水飞蓟宾可以浓度依赖性的降低细胞内的脂滴含量。PA和OA的处理可以显著性增加细胞内的TG含量,降低细胞内2-NBDG的含量;水飞蓟宾可以浓度依赖性的降低胞内的TG含量,提高细胞内2-NBDG的含量。Western blot的结果显示,PA和OA处理组的JNK的蛋白磷酸化水平被上调,CFLAR和NRF2蛋白表达量被下调,IRS1的蛋白磷酸化水平被下调;水飞蓟宾可以浓度依赖性的上调CFLAR和NRF2蛋白表达量和IRS1的蛋白磷酸化,下调JNK的蛋白磷酸化。(4)在Ad-sh Cflar处理的NCTC-1469细胞中,模型组的CFLAR的mRNA和蛋白的表达量被明显的抑制了,而水飞蓟宾可以浓度依赖性的解除这种抑制作用。Western blot的结果显示,模型组的NRF2蛋白表达量和IRS1的蛋白磷酸化水平被抑制,而JNK的磷酸化水平被促进;水飞蓟宾可浓度依赖性的降低JNK的磷酸化,促进NRF2蛋白表达量和IRS1的蛋白磷酸化。结论:本文通过四个NASH的模型,即:(1)用MCD饮食处理C57BL/6小鼠;(2)用OA处理HepG2细胞;(3)用PA和OA处理NCTC-1469细胞;(4)用Ad-sh Cflar处理NCTC-1469细胞,研究了水飞蓟宾在NASH模型中对CFLAR-JNK通路的影响。结果发现,水飞蓟宾可以通过激活CFLAR的表达,抑制JNK的磷酸化,进而对其下游的几条通路产生影响,达到改善NASH的目的,其机制包括:(1)通过促进脂氧化和脂质转运出肝脏、抑制脂合成来降低肝细胞内的脂堆积;(2)通过调节IRS1-PI3K-AKT通路改善肝细胞的胰岛素抵抗;(3)通过调节NRF2及其下游的抗氧化酶系和自由基生成酶系的酶活来改善肝细胞的氧化应激紊乱。