【摘 要】
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目的:基于mi RNA122对含有靶序列基因的调节功能,通过应用内源mi RNA对转基因表达的负向调控作用,减少目的基因-天花粉蛋白载体中转基因片段的异位表达,构建细胞毒性基因r AA
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目的:基于mi RNA122对含有靶序列基因的调节功能,通过应用内源mi RNA对转基因表达的负向调控作用,减少目的基因-天花粉蛋白载体中转基因片段的异位表达,构建细胞毒性基因r AAV载体的包装系统。方法:(1)质粒构建:首先,利用分子组装技术将基因片段嵌入由鸡β-肌动蛋白启动子及巨细胞病毒增强子(CBAp)驱动的质粒中,并将插入位点定位于两个末端重复序列(ITR)之间,获得一系列用于r AAV制备的目的基因载体。(2)细胞转染:然后将目的基因构建到腺相关病毒载体,将构建好的重组质粒导入细胞中,检测目的蛋白的表达。(3)双报告基因检测:通过Gaussia Luciferase和Firefly Luciferase报告基因检测,测得报告基因的表达水平,并建立表达mi R122水平更高的细胞株,以增强对mir122T上游基因的调控能力。(4)重组腺相关病毒的包装及纯化:运用q PCR,Western Blot等技术比较原细胞株与新细胞株的一系列生物特性,以检测用于包装r AAV的可行性。结果:内源性和外源性mi R-122具有组织特异性,并可对靶序列基因的表达进行调控;分选获得过表达mi R-122和GLuc的HEK293-mir122-GLuc细胞株,mir122抑制靶序列的表达的作用同样适用于HEK293-mir122-GLuc细胞株,并且在生长速度与转染效率上都优于原有HEK293细胞;并将mir122T序列插入细胞毒性基因表达框的3’端非编码区域以降低工程细胞内毒性基因的表达水平,最终应用该病毒包装系统进行了细胞毒性基因的r AAV载体的制备及感染。结论:细胞毒性基因-天花粉蛋白的重组腺相关病毒包装系统构建成功。
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