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马氏珍珠贝(Pinctadamartensii)是海洋双壳软体动物,是全世界用于培养海水珍珠的重要水产养殖物种。随着海水珍珠养殖量的增加,除了少量的贝肉用于食用,其它的包括外套膜在内的大量加工副产物被直接丢弃。先前文献表明其胶原蛋白为类V型胶原蛋白,而热带常见的罗非鱼的鱼鳞和鱼皮中含有的胶原蛋白为常见的Ⅰ型胶原蛋白。已有文献表明陆生Ⅰ型胶原蛋白水解物对成骨细胞的分化、矿化有促进作用,本研究以罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水解物为对照,探讨珍珠贝外套膜胶原蛋白水解物及其锌螯合物对骨形成的影响,具体研究内容如下:1、珍珠贝外套膜和罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水解物的制备和性质鉴定首先通过凯氏定氮法测得珍珠贝外套膜和罗非鱼鱼鳞中粗蛋白含量分别为59.79%和63.92%(以干基计)。其次采用热水法提取其胶原蛋白,提取率分别为7.063%、8.507% (以干基计)。再其次采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)及紫外光谱扫描和氨基酸组成分析等方法,分析珍珠贝外套膜胶原蛋白的α链分子量分布、图谱特征、氨基酸组成的特点,确定珍珠贝外套膜胶原蛋白为类V型胶原,罗非鱼鱼鳞胶原蛋白为Ⅰ型胶原。最后用胰蛋白酶在相同条件下酶解制备珍珠贝外套膜胶原蛋白水解物(scallop mantle collagen hydrolysates, SH)和罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水解物(tilapia fish scale collgen hydrolysates, TH),再经 HPLC 分析表明 SH 分子量主要分布在500 Da-10 KDa之间,而TH分子量主要分布在500 Da-3 KDa之间。2、珍珠贝外套膜胶原蛋白水解物(SH)对成骨细胞的影响以TH为对照物,研究了 SH对小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1的增殖和分化的影响。具体方法如下:采用噻唑蓝法(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)测定MC3T3-E1细胞的增殖率;用p-nitrophenyl phoSHhate (p-NPP)法测成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phoSHhatase,ALP)的活性;Elisa酶联免疫法检测Ⅰ型胶原蛋白(collagen type Ⅰ,COLⅠ)和骨钙素(osteocalcin, OCN)的分泌量;茜素红染色法测定细胞外基质矿化结节的数量。结果表明:与空白对照组相比,两种胶原蛋白水解物对细胞的增殖性均没有显著的促进作用,但是显著提高细胞ALP活性,促进COLⅠ和OCN的分泌,促进细胞矿化结节的生成。然而,SH对成骨细胞分化矿化的促进作用显著低于TH。800μg/mL浓度的SH和TH与空白对照组相比,均可显著提高ALP的分泌量,与对照组相比分别达151.74%和194.67%,对细胞外基质矿化结节形成量的促进与对照组相比分别达 156.63%、197.95%。3、珍珠贝外套膜胶原蛋白水解物(SH)对破骨细胞分化的影响利用细胞核因子κB受体活化因子受体的配体(RANKL)为诱导剂,体外诱导巨噬细胞RAW264.7分化为破骨细胞,建立了破骨细胞模型。以TH为对照物,MTT法测SH对RAW264.7细胞存活性的影响,用抗酒石酸性磷酸酶(TRAP)染色法评价其对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响,用流式细胞仪测其对破骨细胞凋亡的影响。结果表明,800μg/mL下的SH、TH对RAW264.7细胞均无毒性作用。染色实验和显微镜观察发现400, 800μg/mL浓度的SH、TH均可显著的抑制RAW264.7细胞分化为破骨细胞,且SH的抑制效果低于TH。同时SH、TH作用破骨细胞24 h后可以引起破骨细胞的凋亡,主要是促进其早期凋亡。4、胶原蛋白肽锌螯合物(SH-Zn)对成骨细胞的影响以TH为对照物探讨了 SH螯合锌离子的能力及两者锌螯合物对成骨细胞分化的作用。将SH和TH分别与锌离子螯合,制备胶原蛋白肽锌螯合物SH-Zn、TH-Zn,用全反射傅里叶红外光谱(ATR-FTIR)检测螯合物的结构,原子吸收光谱检测SH-Zn、TH-Zn的螯合率,螯合率分别为4.86和1.62 μg/mg。随后探讨其对成骨细胞增殖分化的影响,结果表明50μg/mL浓度的SH-Zn、TH-Zn处理细胞后与空白对照组相比,细胞增殖性有显著提高,分别达142.31%,和126.93%; ALP的活性提高了 1.56和1.24倍。同时当胶原蛋白肽锌螯合物浓度为12.5-50μg/mL范围时与TH-Zn相比,SH-Zn对成骨细胞的增殖分化效果更为显著。