论文部分内容阅读
(20S)G-Rh2是人参加工成红参过程中产生的次级皂苷,具有出色的抗肿瘤活性。研究表明,(20S)G-Rh2可诱导人白血病细胞、人宫颈癌细胞、人卵巢癌细胞、人肺癌细胞、人肝癌细胞和人乳腺癌细胞在内的多种肿瘤细胞的细胞凋亡,并且(20S)G-Rh2同时启动线粒体途径和和膜死亡受体途径高效杀死癌细胞。(20S)G-Rh2还可通过抑制JNK、Akt、MAPK和β-catenin信号通路诱导肿瘤细胞周期G1期阻滞,抑制肿瘤细胞的生长。在乳腺癌细胞中,(20S)G-Rh2可以抑制microRNA介导的多重药物抵抗。在人多形型恶性胶质瘤细胞中,(20S)G-Rh2通过下调血管内皮生长因子A,抑制EGFR/PI3k/Akt/mTor信号通路,降低肿瘤细胞的侵袭转移能力。动物水平研究表明,(20S)G-Rh2同样抑制多种种植瘤在小鼠中的生长。本文旨在通过对(20S)G-Rh2相互作用蛋白质的研究,揭示(20S)G-Rh2的细胞内靶点,并最终阐述(20S)G-Rh2抗肿瘤作用的分子机制。为探索与(20S)G-Rh2相互作用的蛋白质,我们分别使用(20S)G-Rh2-PEGA树脂和(20R)G-Rh2-PEGA树脂对人肝癌细胞HepG2的全细胞裂解液进行了pull-down分析,通过液相色谱串联质谱分析获得了381个蛋白质。通过比较上述蛋白质在(20S)G-Rh2-PEGA树脂和(20R)G-Rh2-PEGA树脂的相对丰度,我们获得了113个与(20S)G-Rh2具有较强结合能力的蛋白质。通过检索上述蛋白质在肝细胞癌中的相对表达水平,我们确定了13个在肝癌细胞中高表达的蛋白质。结合(20S)G-Rh2相互作用蛋白质组的GO分析,最终选择Annexin A2进行深入的功能研究。Annexin A2蛋白质是重要的多功能蛋白质,在细胞增殖、细胞迁移、细胞粘附等过程中发挥重要作用。Annexin A2蛋白质可以通过膜结构依赖的途径,与S100家族蛋白形成复合体,促进蛋白质在膜表面的募集,促进细胞增殖和细胞迁移;非膜结构定位的Annexin A2蛋白质通过促进转录因子STAT3、STAT6和NF-κB的激活,上调下游炎症因子和抗细胞凋亡基因的表达,促进细胞的生存。在多种肿瘤细胞中,Annexin A2蛋白质过度表达,促进肿瘤细胞的生存、生长、迁移以及耐药性的产生。为检测Annexin A2蛋白质与(20S)G-Rh2的直接相互作用,我们进行了等温滴定量热分析、分子对接分析、竞争性pull-down分析和热漂移分析,最终确定Annexin A2蛋白质直接结合(20S)G-Rh2,证明了Annexin A2蛋白质是(20S)G-Rh2的细胞内的靶点。在肝细胞癌的发生和发展过程中,NF-κB对肿瘤进程有促进作用。早期肝脏损伤激活NF-κB,上调促生存基因的表达,抑制受损细胞的死亡;同时,通过表达、分泌炎症因子,促进了周边正常细胞向肿瘤细胞的转变,促进癌症的发生。肿瘤形成后,NF-κB调控抗细胞凋亡基因的大量表达,使肿瘤产生耐药性;炎症因子和趋化因子的过度表达改变肿瘤周边的微环境,促进了其他细胞的癌变和肿瘤组织的血管生成作用。Annexin A2蛋白质可结合NF-κB p50亚基蛋白质,促进细胞核共定位,促进NF-κB的转录激活,上调抗细胞凋亡基因的表达,使肿瘤细胞产生耐药性,促进肿瘤的发展。本研究中,(20S)G-Rh2结合Annexin A2蛋白质,并抑制其与NF-κB p50亚基蛋白质相互作用和细胞核共定位,抑制了NF-κB的转录激活,进而下调抗细胞凋亡基因的表达,促进细胞凋亡的发生,进而抑制肿瘤的生长。本文还通过分子对接分析和热漂移分析研究了Annexin A2蛋白质与其他人参皂苷的相互作用,发现人参皂苷Rg5、Rk1和Compound K结合Annexin A2蛋白质。三种皂苷结合Annexin A2蛋白质,抑制其与NF-κB p50亚基蛋白质相互作用和细胞核共定位,抑制了NF-κB的转录激活,通过下调抗细胞凋亡基因的表达,促进细胞凋亡的发生,抑制肿瘤生长。取得的主要成就:1.建立通过(20S)G-Rh2-PEGA树脂进行(20S)G-Rh2-pull-down方法结合液相色谱-串联质谱分析鉴定了HepG2细胞中(20S)G-Rh2的相互作用蛋白质组,并通过分析获得了HepG2细胞中(20S)G-Rh2的相互作用蛋白质组的基因注释特征及肿瘤组织中的相对表达水平;2.通过等温滴定量热分析、分子对接分析、竞争性pull-down分析和热漂移分析确定了Annexin A2蛋白质和(20S)G-Rh2的相互作用,并构建了(20S)G-Rh2结合缺陷型突变体Annexin A2-K302A;3.证明了(20S)G-Rh2通过与靶点蛋白质Annexin A2的相互作用抑制肿瘤细胞生长的分子机制:(20S)G-Rh2结合Annexin A2蛋白质,抑制了Annexin A2蛋白质与NF-κB p50亚基蛋白质的相互作用和细胞核共定位,抑制了NF-κB的转录激活和下游抗细胞凋亡基因X-IAP、c-IAP1、c-IAP2和Survivin的表达,进而促进Caspase 9的激活,导致HepG2细胞的细胞凋亡;4.筛选获得了Annexin A2蛋白质的天然小分子化合物类拮抗剂,人参皂苷Rg5、Rk1和Compound K,并深入阐明了三种人参皂苷通过靶向Annexin A2抑制肿瘤生长的分子机制:人参皂苷Rg5、Rk1和Compound K结合Annexin A2蛋白质,抑制了Annexin A2蛋白质与NF-κB p50亚基蛋白质的相互作用和细胞核共定位,抑制了NF-κB的转录激活和下游抗细胞凋亡基因X-IAP、c-IAP1、c-IAP2和Survivin的表达,促进Caspase 9的激活和HepG2细胞凋亡的发生。