背景和目的:中枢神经系统疾病激活免疫系统分为经典通路如多发性硬化中免疫炎性反应和替代通路如卒中的免疫炎性反应。多发性硬化症是中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘性自身免疫性疾病,是年轻劳动力非创伤性神经功能障碍的主要原因,CD4~+T细胞介导的自身免疫是目前重要的发病机制。脑出血是一类高致残率、高致死率的卒中,缺乏有效的治疗手段。外周淋巴细胞浸润脑内,是脑出血继发性脑损伤的重要原因,其中CD4~+T细胞是参与其中的主要细胞类型,减少CD4~+T在中枢神经系统的数量可以减轻脑出血的临床症状。二期临床实验结果表明,抑制外周免疫细胞向中枢神经系统浸润,可以有效减轻脑出血症状改善脑出血预后。O-GlcNAc糖基化是一类发生在细胞内蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基的单糖基的可逆性修饰,广泛参与细胞信号转导等生理活动,并大量参与肿瘤细胞迁移浸润。我们旨在探索多发性硬化和脑出血后CD4~+T细胞O-GlcNAc糖基化修饰水平变化,明确调控CD4~+T细胞O-GlcNAc糖基化修饰水平对多发性硬化和脑出血的影响及相关机制。方法:利用流式细胞术和免疫印迹法探索多发性硬化和脑出血小鼠模型中外周CD4~+T细胞O-GlcNAc糖基化修饰水平。通过Cre-loxp系统构建CD4~+T细胞靶向性O-GlcNAc糖基化修饰水平下调的小鼠后,验证多发性硬化和脑出血动物模型中,CD4~+T细胞O-GlcNAc糖基化修饰水平下调对疾病的症状严重程度和炎症免疫反应的影响。通过对外周CD4~+T细胞的转录组测序寻找差异基因,并通过差异基因功能富集分析进一步明确相关通路。通过Transwell实验,验证CD4~+T细胞O-GlcNAc糖基化修饰水平和其迁移能力的关系。通过免疫共沉淀实验证实细胞迁移相关蛋白Dedicator of cytokinesis(DOCK)8存在O-GlcNAc糖基化修饰。通过过表达DOCK8后进行质谱分析,寻找DOCK8的O-GlcNAc糖基化修饰位点。构建DOCK8的O-GlcNAc糖基化修饰位点点突变DOCK8质粒,并转染细胞,寻找其影响O-GlcNAc糖基化修饰水平和细胞迁移功能的关键修饰位点。结果:多发性硬化和脑出血小鼠模型外周CD4~+T细胞较对照组小鼠O-GlcNAc糖基化修饰水平升高。通过构建CD4~+T细胞靶向性O-GlcNAc糖基化修饰水平下调的小鼠,我们发现下调CD4~+T细胞O-GlcNAc糖基化修饰水平,可以明显改善多发性硬化和脑出血小鼠模型的症状评分、减轻中枢神经系统内CD4~+T细胞的浸润程度。进一步对多发性硬化小鼠模型脾脏CD4~+T细胞进行转录组测序寻找差异基因表达,并进行功能富集分析发现,细胞粘附迁移相关的基因通路发生明显变化。通过Transwell实验,我们证实CD4~+T细胞迁移后,其O-GlcNAc糖基化修饰水平上调;上调或下调O-GlcNAc糖基化修饰水平,CD4~+T细胞迁移能力相应增强或减弱。通过免疫共沉淀实验证实细胞迁移相关蛋白质中DOCK8存在O-GlcNAc糖基化修饰。通过质谱分析发现DOCK8存在多个O-GlcNAc糖基化修饰位点。构建其O-GlcNAc糖基化修饰位点相应的点突变质粒,并转染细胞后发现,Thr1920位点突变可以明显影响DOCK8的O-GlcNAc糖基化水平,参与细胞迁移。结论:多发性硬化和脑出血小鼠模型中外周CD4~+T细胞O-GlcNAc糖基化修饰水平升高。降低CD4~+T细胞O-GlcNAc糖基化修饰水平后,多发性硬化和脑出血小鼠模型疾病症状改善。其机制可能是DOCK8的Thr1920位点的O-GlcNAc糖基化修饰水平下降影响了DOCK8蛋白功能最终导致CD4~+T细胞的迁移能力减弱。降低CD4~+T细胞O-GlcNAc糖基化修饰水平可以减轻多发性硬化和脑出血的严重性,这为寻找多发性硬化和脑出血的治疗靶点提供了新的方向。