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背景卵泡是卵巢的基本结构及功能单位。女性出生时,双侧卵巢内储存大量处于休眠阶段的原始卵泡。进入青春期后,99%的原始卵泡发生闭锁,仅剩不到1%的原始卵泡在体内性激素水平刺激下,卵泡体积由小及大,颗粒细胞形态也由单层扁平状变为多层柱状,并逐步分化为有功能的外层卵泡膜细胞和内层颗粒细胞。随着卵泡的生长发育,初级卵母细胞发生减数分裂,卵泡腔逐渐形成,依次经历初级卵泡、次级卵泡、窦前卵泡阶段最后发育为成熟卵泡并最终排出卵子。随着女性年龄的增加,卵巢内储存的原始卵泡数量逐渐减少,尤其是女性35岁后的原始卵泡数量加速减少。一旦因为各种原因导致卵巢内原始卵泡提前耗竭,则会发生原发性卵巢功能不全(primaryovarian insufficiency,POI)。因此,维持原始卵泡池对延长女性生殖寿命最为关键。原始卵泡激活和早期卵泡生长发育受多种细胞信号通路调控,如Hippo通路、PI3K-PTEN-AKT-FOXO3通路等,且至今未阐明清楚。.Sirtuins是一个存在于哺乳动物中的NAD+依赖性的蛋白去乙酰化酶家族,在组织中的表达具有高度保守性,主要参与包括细胞衰老、代谢、凋亡、细胞周期、细胞存活和基因组稳定性等多个生理事件的调控过程。哺乳动物Sirtuin家族具有7个成员,这些成员因其亚细胞定位和蛋白结构特异性不同,因而其活性和功能也有所不同。Sirtuin1、Sirtuin6和Sirtuin7主要定位于细胞核,Sirtuin2定位于细胞质,而Sirtuin3、Sirtuin4和Sirtuin5则表达定位于线粒体。有研究表明Sirtuin家族基因与女性卵巢卵泡发育及卵母细胞成熟等密切相关:在肥胖大鼠模型的研究中,Sirtuin1可改善由高卡路里饮食诱导产生的始基卵泡丢失及卵泡闭锁;而过表达Sirtuin1则可模拟热量限制饮食所诱导的小鼠始基卵泡储备的维持。提示Sirtuin1可能参与早期卵泡发育调控过程。鉴于此,本课题以小鼠卵巢为研究对象,探索Sirtuin家族基因在各发育阶段卵泡中的表达和定位情况;以人原代颗粒细胞及KGN细胞系为研究对象,重点阐述Sirtuin1在早期卵泡发育中的调控作用及分子机制。目的1.探索Sirtuin家族基因在卵巢卵泡发育过程中的表达模式及空间定位;2.阐明Sirtuin1对早期卵泡发育的调控作用;3.研究Sirtuin1对颗粒细胞增殖与凋亡的影响及机制;4.以及初步探究Sirtuin1对颗粒细胞线粒体功能的潜在调控作用。方法本研究运用rea1 time-PCR检测不同日龄新生小鼠卵巢Sirtuin家族基因的相对表达水平;运用IHC技术检测Sirtuin1、Sirtuin4和Sirtuin6在小鼠各级卵泡中的定位及表达情况;应用Sirtuin1腺病毒过表达体系和HE染色验证Sirtuin1对早期卵泡发育的影响;应用Sirtuin1腺病毒过表达体系和转染siRNA沉默Sirtuin1研究Sirtuin1对颗粒细胞增殖及凋亡的影响;运用real time-PCR和Western Blot研究Sirtuin1对颗粒细胞线粒体功能的潜在影响机制。结果1.Sirtuin家族7个基因在卵巢卵泡发育各阶段表达情况不同。其中,Sirtuin1、Sirtuin 4和Sirtuin6的表达水平随着卵泡的发育而逐渐下降;Sirtuin5的表达则先上升后下降,且在次级卵泡阶段表达水平达到最高值。从7个基因于各时期的相对表达比较来看:Sirtuin2于各级卵泡中的表达量始终较高水平;Sirtuin7在原始卵泡阶段表达水平相对较低,而在其它发育阶段则相对较高;Sirtuin6仅高表达于始基卵泡阶段。2.对小鼠卵巢卵泡的免疫组化结果提示:Sirtuin1集中表达于早期卵泡颗粒细胞中,细胞质与细胞核中均有阳性信号,而卵母细胞及卵巢间质细胞中几乎无表达;Sirtuin4和Sirtuin6表达于颗粒细胞和卵母细胞胞质中,黄体中也有较强表达。3.通过小鼠卵巢体外培养体系培养不同日龄卵巢,采用腺病毒感染过表达Sirtuin1,结果发现Sirtuin1过表达可抑制原始卵泡向初级卵泡转化以及初级卵泡向次级卵泡的转化进程,表明Sirtuin1延缓了早期卵泡发育进程。4.干扰Sirtuin1表达水平显著影响原代颗粒细胞及KGN细胞增殖,可能与调控CCN2的表达水平改变有关。5.感染Sirtuin1表达水平显著影响原代颗粒细胞及KGN细胞凋亡,可能与调控AMPK/PI3 K/Akt1/caspase表达水平相关。6.KGN中Sirtuin1表达水平改变影响了线粒体融合蛋白2(mitofusin,Mfn2)以及线粒体自噬相关蛋白Atg5、Beclin1和LC3B的表达,提示Sirtuin1可能通过影响颗粒细胞线粒体功能进而影响卵泡发育。结论Sirtuin家族基因在卵泡发育过程中具有不同的表达模式,Sirtuin1、Sirtuin 4和Sirtuin6的表达水平随着卵巢卵泡发育进程而逐渐降低。过表达Sirtuin1可延缓原始卵泡向初级卵泡以及初级卵泡向次级卵泡转化过程,提示sirtuin1可能参与早期卵泡发育调控过程。Sirtuin1对早期卵泡发育的调控可能与Sirtuin1影响颗粒细胞增殖与凋亡有关,且干扰Sirtuin1表达水平改变了线粒体融合蛋白和自噬相关蛋白的表达,提示Sirtuin1对卵泡发育的调控亦可能是通过影响颗粒细胞线粒体功能实现的。