利用RNA-seq探究视紫红质P23H突变导致视网膜色素变性的发病机制

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实验背景:P23H突变导致常染色体显性视网膜色素变性(adRP)的发病机制复杂多样,以往的研究表明内质网应激、细胞焦亡、氧化应激、钙蛋白酶以及胶质细胞的激活等机制参与了该病的疾病进展。然而,不同机制的作用和关系尚不清楚。本研究旨在探讨并评估P23H相关adRP的发病机制,并寻找与疾病进展相关的新基因。实验方法:本研究以C57BL/6J(B6J)小鼠作为对照,对出生后7天(PN07),出生后10天(PN10),出生后14天(PN14),出生后21天(PN21)以及出生后35天(PN35)的RhoP23H/P23H小鼠视网膜进行苏木素—伊红(HE)染色和视网膜电图(ERG)实验以评估视网膜结构和功能。接下来,用PN07、PN14、PN21和PN35的小鼠视网膜总RNA进行转录组测序(RNA-seq);随后,对RNA-seq数据进行生物信息学相关的差异基因分析以及GO和KEGG富集分析。此外,来自其他已发表研究中的CRISPR全基因组筛选文库的数据和RNA-seq数据被用来生成自定义基因集以进行基因集富集分析(GSEA)。接下来,我们将上述基因集合与我们的RNA-seq数据取交集,以识别候选基因,并通过实时定量PCR(qPCR)与蛋白免疫印迹实验(WB)进行表达水平的验证。实验结果:GO和KEGG富集分析结果与视网膜结构和功能疾病表型基本一致。GSEA结果显示,除PN07外,所有时间点均观察到细胞焦亡,PN14处存在内质网应激、细胞焦亡和氧化应激;PN35时能观察到内质网应激和细胞焦亡。数据取交集共得到22个候选基因,选择其中的Ifi44、Kcnj14以及C4b进行qPCR验证,qPCR结果与RNA-seq数据相关性较高,三个基因在两组小鼠间mRNA水平均有显著差异;对Ifi44与Kcnj14基因进行了 WB验证,IFI44蛋白水平变化与疾病进展变化密切,KCNJ14蛋白水平两组小鼠间无显著差异。结论:细胞焦亡和内质网应激可能在RP进展中起重要作用。我们鉴定出的与内质网应激和细胞焦亡相关的差异表达基因簇(Ifi44、Kcnj4以及C4b)值得进一步研究。这些发现为P23H相关adRP的研究提供了新的视角。
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