一、目的　　 近年来,国内外大量研究文献都表明氧化应激是许多病理因素造成心血管损伤的共同机制,在许多心血管疾病的病理过程中都有过量氧自由基产生,同时抗氧自由基防御机制却受到抑制,如动脉粥样硬化(AS)、高血压病、缺血性心脏病、高脂血症等。氧化应激损伤心肌细胞的转归与氧化应激的程度相关,在一定应激强度范围内,氧化应激对心肌细胞造成的损伤是可逆的,而超过一定限度,则对心肌细胞造成不可逆的损伤,主要包括心肌细胞的凋亡和坏死。　　 Prohibitin又称抗增殖蛋白,最初发现于1991年,是核基因编码的蛋白质,主要存在于线粒体和细胞核内。近期的研究发现,prohibitin蛋白参与了心肌IR及氧化应激的病理过程,并且其在氧化应激过程中通过稳定线粒体结构,维持线粒体内膜完整性从而发挥其减少心肌细胞凋亡,保护心肌细胞的作用。并且,还有学者通过在肠上皮细胞中的研究发现,IL-6可能是prohibitin蛋白的上游调控因子,通过转录信号转导子与激活子(signal transducer and activator 0ftranscription 3,STAT3)这条细胞信号通路实现对其表达调控。　　 因此,我们推测在体外培养的心肌细胞中,给予一定量的IL-6预处理也可能通过增加prohibitin的表达减轻H2O2导致的心肌细胞氧化应激损伤。因此,我们拟采用在正常体外培养的乳鼠心肌细胞中加入一定量的IL-6干预,通过实时荧光定量PCR法及Western blot法检验心肌细胞中prohibitin mRNA及蛋白的表达情况。通过SiRNA干扰技术(small interfering RNA,SiRNA)沉默prohibitin基因,检测氧化应激心肌细胞活力及凋亡等情况,以便进一步明确prohibitin蛋白在氧化应激心肌细胞中的作用,初步探讨IL-6预处理保护氧化应激心肌细胞损伤的部分分子机制。　　 二、方法　　 1.乳鼠心肌细胞的原代培养 参照Paul Simpson方法稍加改进,外科无菌条件下取出乳鼠心脏,用胰酶逐步消化法分离单个心肌细胞,接种至培养瓶中,采取差速贴壁分离法以去除心肌成纤维细胞,得到纯度较高的心肌细胞用于实验。　　 2.H2O2致心肌细胞氧化应激模型建立 心肌细胞正常培养3天后,选取细胞密度在95％以上的,自律性搏动120～140次/min的心肌细胞用于实验,选取不同浓度与时间点的H2O2干预心肌细胞,选择合适的浓度及干预时间用于后面的实验。　　 3.MTT比色法测定心肌细胞活力 将心肌细胞接种于九十六孔板,按实验分组给予相应的处理因素后,按MTT法具体操作步骤进行处理,在酶标仪490nm处测其OD值并计算各组心肌细胞存活率。　　 4.流式细胞仪(FCM)检测心肌细胞凋亡率 心肌细胞按照实验分组处理后,用不含EDTA的胰酶消化收集,以Annexin V-FITC/Propidium Iodide进行染色,室温、避光、反应5～15min,再上流式细胞仪(激发波长488nm,发射波长530nm)进行检测。　　 5.凋亡细胞形态学观察 心肌细胞按实验分组处理后,按照Heochst33342/PI双染试剂盒说明说进行染色,在倒置荧光显微镜下观察凋亡细胞及坏死细胞形态并拍照。Heochst 33342产生兰色荧光,PI产生红色荧光。　　 6.心肌细胞GSH的检测 将心肌细胞接种于六孔培养板中,实验分为正常对照组、H2O2组、IL-6预处理+H2O2组,其中IL-6预处理的浓度分别为1、5、10、50、100ng/mL共7组,处理完毕后,按照谷胱甘肽GSH(除蛋白)检测试剂盒说明书进行操作,在酶标仪420nm处测量每组OD值并计算各组细胞内GSH的含量。实验重复三次以上。计算公式:GSH含量(gGSH/L)=(测定管吸光度-空白管吸光度)×标准管浓度(20μmol/L)×GSH分子量(307)×稀释倍数/(标准管吸光度-空白管吸光度)。　　 7.SiRNA沉默心肌细胞PHB基因 调合适的细胞浓度分别接种于六孔板或九十六孔板中,正常培养3天左右,当贴璧细胞达到80％～90％融合时,取细胞进行实验。实验共分为6组:正常对照组、H2O2组、H2O2+IL-6组、H2O2+IL-6+阴性转染组、SiRNA转染组和H2O2+IL-6+SiRNA转染组。具体方法见Santa CruzSiRNA转染试剂盒说明。转染心肌细胞48～72h后收集细胞,再进行Westernblot实验和MTT检测心肌细胞活力。　　 8.实时定量PCR检测心肌细胞内PHB mRNA的表达心肌细胞按照2×107/孔的浓度接种至六孔板中,取正常培养3天后状态最佳的心肌细胞用于实验。实验分组依次为:正常对照组、IL-61、5、10、50、100 ng/mL五个浓度组,IL-6干预心肌细胞8h后,用Trizol提取心肌细胞总RNA,在紫外分光光度计上测定OD260/OD280,鉴定提取的RNA纯度和浓度。然后,反转录合成cDNA,根据Gene Bank中PHB、GAPDH的基因序列资料,借助于计算机软件PrimerPremier5.0设计引物,上机进行目的基因的荧光定量检测。　　 9.Western blot法检测心肌细胞PHB蛋白的表达 心肌细胞按实验分组处理完成后,以Western及IP细胞裂解液提取心肌细胞蛋白,BCA法进行蛋白定量,进行蛋白印迹实验。以GAPDH为内参,将处理好的蛋白质样品进行SDS-PAGE分离,电泳结束后将蛋白质转移到PVDF膜上,封闭后,孵育一抗和二抗,ECL 显色,KODAK Image Station 2000MM成像系统采集图像,获得图像用图像处理软件Image Tool 3.0测定并分析条带灰度值以检测PHB的表达水平。　　 三、结论　　 1.H2O2能明显抑制心肌细胞活力,促进心肌细胞凋亡的发生；　　 2.低浓度的IL-6预处理心肌细胞可显著减轻H2O2致心肌细胞损伤,表现在增加心肌细胞活力和降低细胞凋亡率两方面；　　 3.低浓度IL-6预处理心肌细胞可明显上调心肌细胞GSH表达水平,从而减轻心肌细胞氧化应激损伤；　　 4.H2O2能引起心肌细胞内PHB的表达代偿增高,过量表达的PHB可对抗H2O2致心肌细胞氧化应激损伤作用,增加心肌细胞活力；　　 5.低浓度IL-6预处理心肌细胞能显著增加心肌细胞内PHB mRNA及蛋白的表达。