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在我国,随着环境污染的加剧,吸烟人群增长以及个人生活压力的增大,肺癌的发病率和死亡率一直居高不下,位居所有恶性肿瘤的首位。肺癌也是中国癌症死亡的主要原因[1]。和其它复杂疾病一样,环境因素和遗传因素共同作用导致肺癌,但其发病机制尚待探讨。为了研究遗传因素在肺癌发生和发展进程中的作用,我们以与肺癌易感性高度相关的SNP(single Nucleotide Polymorphisms,单核苷酸多态性)为切入点,利用分子生物学和表观遗传学技术研究肺癌易感性rs1663689的生物学功能。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是最常见的人类可遗传变异。基于大样本全基因组关联研究(Genome-wide Association Study,GWAS)的手段,已发现大量疾病关联SNPs。这些疾病关联SNPs多位于基因组非编码序列,探讨它们在疾病发生中的生物学功能将有助于对复杂性疾病遗传机制的认识。已有的研究结果显示,位于10p14的单核苷酸多态性位点rs1663689与肺癌的易感性密切相关。但该SNP位于基因间的区域,距离其最近功能明确的基因GATA3为908kb,这对其生物学功能的研究提出了挑战。增强子(enhancer)是基因组中特定的DNA序列,长度在几百个核苷酸到2Kb不等,能够显著增强靶基因启动子的转录活性,常带有特异的组蛋白修饰H3K4mel和H3K27ac。在人类基因组中,和靶基因具有很远线性距离的增强子元件,可以通过与靶基因之间形成环(loop),在空间上靠近靶基因启动子区,并且招募转录因子促进靶基因的转录。而存在于增强子内部的SNPs,往往可以通过改变结合在该位点处转录因子的种类及数量,影响调控元件的功能,改变增强子元件与靶基因的结合,这为探讨基因非编码区疾病关联SNPs提供了十分有益的线索。本课题旨在以rs1663689为切入点,通过鉴定发现与rs1663689具有直接功能联系的增强子元件及确定相应增强子元件的生物学功能,探讨rs1663689位点遗传变异在肺癌发生发展中的生物学意义。为此,我们首先分析了 4株肺癌细胞(A549、H1299、95-C、95-D)和1株正常支气管上皮细胞(Beas-2b)中rs1663689位点的基因型,结果提示rs1663689位点基因型与肺癌细胞表型具有相关性。通过生物信息学分析以及分子生物学研究方法,我们发现10p14-En在正常肺支气管上皮细胞Beas-2b中表现出增强子的活性,而在两株肺癌细胞A549和H1299中不具有增强子的调控活性。并且rs1663689的基因型会影响调控元件10p14-En的活性。为了探究10p14-En增强子的靶基因及其生物学效应,我们首先对rs1663689上下游2Mb范围内基因(GATA3、TAF3、KIN17、ITIH2 和 ITIH5)在细胞中进行了 mRNA 水平的检测。在5株细胞中的检测结果显示,ITIH5基因在正常支气管上皮细胞Beas-2b中高表达,而在4株肺癌细胞中低表达,与rs1663689基因型呈现相关性。接着我们运用染色质三维构象捕获技术(Chromosome Conformation Capture,3C)分析证实,10p14-En与ITIH5基因启动子区在空间上相互靠近。借助于最新的CRISPR/Cas9基因敲除技术,在Beas-2b细胞中敲除10p14-En增强子元件后,ITIH5基因的mRNA水平显著下降。这些结果均证实,ITIH5是10p14-En增强子的直接靶基因。ITIH5基因作为一个肿瘤抑制因子,其蛋白主要功能是维持细胞外基质的稳定性,其在肺癌细胞中表达量的下降可促进肺癌细胞的迁移。对TCGA数据库的分析结果显示,ITIH5在肺癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织。我们在低表达ITIH5的肺癌细胞系中过表达TIH5,显著抑制肺癌细胞的迁移。本研究结果提示,肺癌细胞中风险SNP(s1663689)突变型(C),可通过抑制其所在增强子元件10p14-En的活性,降低靶基因ITIH5的转录水平,促进肺癌细胞迁移。