G蛋白偶联受体(GPCRs)在制药领域中占有极其重要的地位，市售西药中有1／2的作用靶点是GPCR，在中药中以GPCRs为靶点进行药物筛选和分子机理研究尚未见报道。在遗传背景清楚的宿主中表达(；PCR并纯化其蛋白不仅可以用作受体亚型、嵌合受体、突变受体等药理和生化分析的研究中，而且还可以分析GPCR与G蛋白的相互作用以及由此所引起的信号传导，寻找可以作为药物的先导物、孤儿GPCR的配体等。 甲醇酵母表达系统是发展迅速、应月广泛的一种真核表达系统与大肠杆菌等原核表达系统相比，它能对表达的蛋白进行翻译后的修饰和加工；与杆状病毒、哺乳动物细胞表达系统相比，它又具有培养成本低、产量高、便于产物的分离和纯化等优点。甲醇酵母中以可调控的AOXl强启动子控制下表达异源基因，其产物较酿酒酵母表达的更接近真核生物甚至人类。因此利用甲醇酵母表达G蛋白偶联受体，不但可以进行快速、高通量的配体和药物先导物的筛选；而且可以提供足量的GPCR蛋白进行蛋白结构、受体亚型、嵌合受体、突变受体的药理和生化分析。因此，以甲醇酵母为宿主的表达体系具有其他系统不可比拟的优点。 内皮细胞分化因子(edg一1)和缓激肽受体(B2R)同属于G蛋白偶联的受体超家族，都与内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)等多种信号途径偶联。其中edg—l与心血管疾病、免疫系统疾病密切相关：而B2R与心血管疾病及各种炎症密切相关。 edg—l和B：R都尚未在酵母细胞中表达。为了开发一种操作简便，成本低廉的以edg一1和B2R为靶点的药物筛选系统，以期获得抗心血管疾病的药物或其他用途的药物。我们用RT一PCR方法从人脐静脉内皮细胞中克隆了edg—l受体和B2R基因，首次利用甲醇酵母Pichiapastoris来表达edg一1和B2R受体，并对表达受体的细胞定位和功能进行了研究。 在B2R基因的C一端接上绿色荧光蛋白基因(EGFP)作报告基因，构建了EGFP融合的B2R—EGFP基因，将B2R—EGFP融合基因克隆到甲醇酵母整合型表达载体pPIC9k上。利用pPIC9k的Q信号肽序列促进膜受体的跨膜分布，电击转化P.pastorisGS¨5菌株，抗生素G418浓度梯度筛选高抗性转化子，重组菌株用甲醇诱导表达。流式细胞仪分析表明B2R—EGFP在GS¨5中获得了很强的表达：Western印迹杂交结果证实了表达产物为B2R—EGFP融合受体蛋白；在激光共聚焦显微镜下重组菌株观察到很强的绿色荧光；虽然表达的受体蛋白也有内膜分布，但免疫荧光分析证实表达的受体蛋白大量定位到了细胞膜上。 免疫荧光分析还证明了表达的B2R受体蛋白具有同配体结合的功能。 同样构建pPIC9k—edg一卜EGFP表达载体，电转化P.pastorisGS¨5菌株，但不筛选高G418抗性转化子，甲醇诱导表达。诱导的转化子流式细胞仪检测表明edg一卜EGFP在GS¨5中获得了很强的表达：Western印迹杂交结果证实了表达产物为edg一卜EGFP融合受体蛋白：在激光共聚焦显微镜下重组菌株发出很强的绿色荧光：免疫荧光分析证实表达的重组受体大量定位于酵母细胞膜上 鞘氨醇一卜磷酸是edg—l受体的高亲和性配体，克隆并原核表达了鞘氨醇激酶基因(SphK)，利用纯化的鞘氨醇激酶制备γ一32P标记的鞘氨醇一l一磷酸(S一1一32P)，放射性标记的配体结合分析表明重组edg—l受体具有配体结合功能。 鞘氨醇一1一磷酸明显降低重组酵母GS115：：pPIC9K—edg一卜EGFP的生长速度，表明重组edg—l受体和酵母细胞内信号途径偶联，受体具有生物学功能。我们的研究为进一步利用B2R和edg一1受体建立药物筛选系统打下了基础。