背景和目的严重的创伤或某些疾病可以导致关节软骨损伤,发生一系列病理变化,并造成关节软骨不可逆的退行性改变,最终引发骨关节炎(Osteoarthritis,OA)。据世界卫生组织(WHO)统计,60岁以上人群中约有50%患病,75岁以上人群中的OA发病率高达80%。目前全世界OA患者有3.6亿人,国内最新统计资料调查显示,我国骨关节炎患者已达1.2亿。据美国统计,每年应用于骨关节炎治疗方面的花费大约为5.46亿美元,同时每年至少要进行50万例的关节成形手术。OA的发病通常还伴有关节疼痛,对患者的正常生活产生重大影响。在病情严重时甚至可能导致肢体残疾,大大降低患者的生活质量,该病的最终致残率为53%,故有“头号致残疾病”之称。由于关节软骨的解剖结构较为特殊,其周围没有血管和神经的支配,因此一旦发生损伤就难以进行自我的修复。因此深入研究对软骨损伤的修复机制具有重要的临床价值和社会意义。随着近些年来组织工程技术的飞速发展和不断创新,组织工程软骨逐渐成为一种理想的软骨损伤的新型修复方式。其中,组织工程软骨的细胞来源及诱导方法等问题一直是软骨组织修复领域研究的关键。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)被认为是目前利用组织工程进行软骨构建过程中的一类非常理想的种子细胞,其具有来源广泛、低免疫原性,具有高度的多向分化潜能以及在体外进行多代增殖和培养后仍能够保持原有细胞形态和生理功能等诸多优势。但是,有研究发现,体外培养的MSCs在成软骨分化的后期,并不会分泌大量的细胞外基质进而形成关节软骨,而是继续分化为没有修复作用的肥大化软骨细胞,并最终形成无功能的纤维化软骨或者钙化。因此,如何抑制MSCs来源的软骨细胞向肥大化软骨细胞的分化,并使其保持软骨细胞的相应表型和特性,成为软骨组织工程研究面临的一个重要问题。软骨的形成过程以及软骨组织生物学功能的发挥,这些过程都是通过骨形成蛋白及相关的转录因子和信号通路等多种因子综合调控的结果,同时这些调控因子形成复杂的调控网络。近年来的研究表明,细胞内的微小RNA(micro RNA,缩写为mi RNA)在软骨细胞分化以及生物学功能发挥的过程中起着关键性的调控作用。在众多的mi RNA中,miR-29b可以正向调节骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,bmscs)的成骨分化。已有研究证实,组蛋白去乙酰化酶4(histonedeacetylase4,hdac4)是mir-29b的下游靶基因之一。另外,hdac4可以通过降低软骨细胞肥大化的标志基因runx2的表达,从而抑制软骨细胞肥大化。由此,我们推测mir-29b很可能通过调节其下游的hdac4来影响bmscs成软骨细胞分化的过程,使之向肥大化的软骨细胞分化。本研究应用mir-29b过表达和mir-29b抑制技术,针对这一可能调控过程及机制进行了相应的实验研究。材料与方法在课题组已建立的mscs软骨肥大化诱导体系的基础上,本研究对mir-29b在mscs成软骨分化过程中的作用及其机制进行探讨。一、采用已建立mscs软骨肥大化诱导体系培养细胞团。番红o固绿染色法检测细胞团的硫酸软骨素的表达情况,确定体外成软骨肥大化诱导成功与否。并分别取3、7、14、21、28d的细胞团,采用rt-pcr检测colii、colx、runx2、sox9、hdac4和mir-29b的mrna的表达情况。二、在前一部分研究的基础上进行mir-29b干预mscs成软骨肥大化的实验。实验分组包括:①过表达组,转染pre-mir-29b;②过表达对照组,转染negativecontrol;③抑制组,转染antagomir-29b;④抑制对照组,转染antagomir-29bcontrol。所有实验组均于细胞诱导的第10d进行首次转染,然后每间隔2d进行补充转染。分别取诱导培养至第14d、21d和28d的软骨细胞,用rt-pcr的方法检测mir-29b在过表达和抑制表达的情况下对软骨肥大化的相关基因colii、colx、sox9、mmp13、runx2等的mrna表达的影响。运用番红o固绿染色法检测抑制组软骨细胞中硫酸软骨素分泌情况。利用免疫组化和westernblot方法,从蛋白水平证实mir-29b在软骨肥大化的调控作用。结果一、番红o固绿染色法发现,与对照组相比,肥大化组的软骨细胞硫酸软骨素分泌减少,尤其在诱导28d时差异显著(p<0.05),显示体外诱导肥大化成功。软骨标志性基因coliimrna的表达:成软骨阶段呈上升趋势,肥大化阶段呈下降趋势(p<0.05);肥大化相关基因colxmrna表达:成软骨阶段表达量较低,肥大化阶段显著升高(p<0.05)。runx2和mir-29b的表达量在成软骨阶段水平较低,在软骨细胞肥大化的阶段则显著上升(p<0.05);相反,sox9的表达在成软骨阶段上升,而处于肥大化阶段的细胞中表达下降(p<0.05)。据此,我们认为下调mir-29b的表达水平可延缓或阻断mscs来源的软骨细胞的肥大化进程。二、利用mi R-29b干预MSCs向成软骨细胞肥大化的方向分化,实验结果显示:在mi R-29b过表达组,软骨分化的相关基因Col II、HDAC4和Sox9的m RNA表达较对照组显著降低(P<0.05),而软骨肥大化的相关基因Col X、MMP13和Runx2的mRNA表达显著升高(P<0.05);在抑制mi R-29b表达组中则相反,软骨细胞肥大的相关基因表达较对照组显著降低(P<0.05),而软骨分化相关基因的表达则会显著升高(P<0.05)。在番红O固绿染色实验中,抑制mi R-29b的细胞细胞外基质的分泌量较对照组显著增多。在免疫组化实验中,抑制mi R-29b的实验组X胶原的表达量较高。Western blot实验检测结果显示:mi R-29b过表达组的Col II、HDAC4和Sox9蛋白水平显著升高(P<0.05),Col X、Runx2的mRNA表达显著下降(P<0.05);而抑制miR-29b表达组中各蛋白的表达情况则与过表达组相反。结论mi R-29b为软骨细胞肥大化的正性调控因子,mi R-29b能促进软骨细胞肥大化进程,抑制miR-29b可延缓软骨细胞肥大化进程。