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诱导多能干细胞(i PSCs)具备类似ESCs的分化潜能及增殖能力,因此其在疾病模型的建立与机理研究、细胞治疗、药物发现与评价、转基因动物生产、动物育种等方面具备较好的应用前景。获得i PSCs的方法有很多,其中导入外源转录因子是最为经典的诱导方法。通过转入OCT4、C-MYC、KLF4和SOX2四个经典重编程因子,已经在多种动物上实现i PSCs的获得。本研究结合SOE PCR和同源重组方法构建了2A肽介导的基于Piggy Bac转座子过表达系统的水牛OCT4、C-MYC、KLF4和SOX2四基因共表达载体PB_OMKS,并利用该载体转染水牛胎儿皮肤成纤维细胞(BFSF),筛选建立了增殖能力较好的水牛胎儿皮肤成纤维细胞过表达细胞系BFSF_OMKS,为进一步探讨水牛体细胞重编程的相关机制奠定基础。本研究还结合RNA-seq技术和生物信息学分析手段对获得的BFSF_OMKS细胞进行转录水平分析,初步探讨了过表达水牛OCT4、C-MYC、KLF4和SOX2基因对水牛体细胞重编程相关信号通路的影响。1.PB_OMKS过表达载体构建本研究通过设计携带同源片段的引物分别扩增获得携带同源臂的OCT4、P2A、C-MYC、E2A片段和KLF4、F2A、SOX2片段,再利用SOE PCR技术将它们分别拼接成OPME片段和KFS片段。最后利用同源重组技术将OPME片段和KFS片段同时连接到同一个携带抗嘌呤霉素基因的Piggy Bac转座子质粒上,并进行PCR鉴定、质粒电泳检测以及DNA测序,确认获得序列信息正确的PB_OMKS过表达载体。2.BFSF_OMKS细胞系的建立和鉴定将构建好的PB_OMKS质粒和转座酶表达质粒共转染BFSF细胞后,使用嘌呤霉素进行细胞筛选,最终成功获得纯化的BFSF_OMKS细胞系。经q RT-PCR鉴定,证明BFSF_OMKS细胞成功过表达外源OCT4、C-MYC、KLF4和SOX2基因,与BFSF细胞相比,BFSF_OMKS细胞的OCT4基因相对表达水平平均上调2231.26倍,SOX2基因平均上调2189.10倍,C-MYC基因平均上调8.46倍,KLF4基因平均上调13.11倍;经细胞免疫荧光染色鉴定,证明该细胞系表达多能性相关蛋白OCT4和SOX2。3.BFSF_OMKS细胞的增殖能力检测对BFSF_OMKS细胞进行增殖能力检测,通过绘制并比较BFSF细胞和BFSF_OMKS细胞的生长曲线,发现本研究获得的BFSF_OMKS细胞增殖速度较BFSF细胞稍慢,但保持着较好的增殖能力和稳定的传代能力,可以维持传代培养一个月以上。同时转录组数据表明,该细胞系表达促生存基因PTPN13、CFLAR和TRAF1。4.BFSF_OMKS的转录水平分析针对BFSF细胞和BFSF_OMKS细胞进行两次生物学重复的转录组测序发现,共检测到1701个差异表达基因(DEGs),其中1255个上调DEGs,446个下调DEGs。针对细胞多能性相关信号通路进行分析发现,相较于BFSF细胞,BFSF_OMKS细胞的LIF、Activin、BMP4和WNT信号被激活,这些信号的相关基因LIF、INHBB、BMP2/4、WNT4/WNT5A等出现显著性上调。此外,BFSF_OMKS表达胚胎干细胞信号FGF2、中胚层发育相关基因DLX5和内胚层发育相关基因ZFHX3。为验证该转录组数据可靠性,针对OCT4、SOX2、LIF、DLX5、FGF2、INHBB、BMP2、BMP4、SMAD9和SMAD1等共20个基因进行引物设计,对测序样品进行q RT-PCR检测,q RTPCR结果与转录组数据一致,证明本次转录组测序获得的数据可靠性较高。以上结果表明,本研究获得的BFSF_OMKS细胞系已经初步进入重编程状态,并且有较好的增殖和传代能力,因此该细胞平台可以用于筛选促进水牛体细胞重编程的小分子化合物,探讨水牛体细胞重编程的相关现象及分子机制。