传统的基因克隆技术需要PCR、酶切、连接等技术,过程繁琐还受到PCR条件和酶切位点的限制,并且还会在克隆中留下许多多余的片段。最近无缝克隆技术的兴起,克服了传统基因克隆技术的缺点。我们开发了一种利用RED重组的无缝克隆技术。利用此项技术进行了 BAC克隆重组,构建了利用锌指核酸酶对TMEM18基因进行基因敲入的供体质粒。并对TMEM18进行了基因敲入的初步研究。RED重组系统是一种源自于λ噬菌体的重组系统,其中exo、bet和gam三个基因表达相应的重组蛋白,介导基因同源重组。pKD46质粒是一种同源重组的辅助性质粒,除了含有受阿拉伯糖启动子paraB调控的表达上述3种重组蛋白的基因外,还含有温度敏感型复制启始位点orR10l。本文采用pKD46质粒介导基因重组。重组过程中为了便于筛选,通常会在打靶DNA中引入抗性筛选基因,我们构建了一个阴阳两性筛选系统。我们用kana抗性基因作为阳性筛选基因,用Ala294Gly突变的pheS作为阴性筛选基因。将两者融合在一起,在大肠杆菌启动子NEOKAN控制之下,构成一个阴阳两性筛选系统。pheS基因编码苯丙氨酰tRNA合成酶的α亚基。该基因的Ala294Gly突变使得其底物结合空间扩大,可以接受对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe),当底物中存在一定浓度的p-Cl-Phe时,p-Cl-Phe被引入到蛋白质中,会对大肠杆菌产生毒性而致细胞死亡[1]。首先我们克隆了这个基因,并将这个基因进行突变。然后我们将突变的pheS基因连接到pZER02载体的Kana抗性基因的上游,与Kana融合,并将其转化大肠杆菌DH5α细胞,进行p-Cl-Phe耐受性实验。结果表明,转化该质粒的细胞除了有Kana抗性外,当p-Cl-Phe的浓度达到15mM时,大肠杆菌DH5α细胞不能生长。这一结果说明该系统具有两性筛选的功能。在这个基础上,我们利用pKD46质粒介导基因重组,建立了 RED重组技术,并进行了 BAC克隆的重组,构建了用于在TMEM18基因中敲入eGFP的供体质粒。第一步,将NEOKAN-mpheS-kana组件重组到含有TMEM18打靶位点的BAC克隆中,利用kana抗性筛选阳性克隆。我们将pKD46质粒转化BAC克隆RP23-25C13细胞,然后用100mM的L-阿拉伯糖诱导重组蛋白表达,制成感受态细胞。PCR合成NEOKAN-PheS-Kana片段,其中两端含有50bp与TMEM18同源。PCR产物经DpnI酶切、电泳和纯化,然后转化含重组蛋白的细胞。涂布于含Kana(25μg/ml)和氯霉素(12.5μg/ml)平板,30℃培养24h后,挑选单克隆进行PCR鉴定。第二步,将eGFP片段重组到BAC克隆中,替换其中的NEOKAN-PheS-Kana组件,使TMEM18与eGFP融合,利用PheS的阴性筛选功能,筛选PheS阴性克隆。我们采用以上同样的方法制得含有重组蛋白的BAC感受态细胞。PCR合成并纯化eGFP片段(其中两端含有50bp与TMEM18同源的片段),转化含重组蛋白的细胞。涂布于含15 mM的p-Cl-Phe和12.5μg/ml的氯霉素平板,30℃培养24h后,挑选单克隆进行PCR鉴定。最终得到TMEM18与eGFP融合的BAC克隆。第三步,我们采用RED重组技术,对TMEM18与eGFP融合部分进行了亚克隆,将eGFP两端各含TMEM18基因1-2kb的部分亚克隆到一个微小的BRR322载体中。我们采用以上同样的方法制得含有重组蛋白的BAC感受态细胞,PCR合成并纯化微小的BRR322载体片段(其中含基本的质粒复制元件和氨苄抗性基因部分,两端分别有50bp与TMEM18同源,以及Nco I、EcoR I酶切位点),转化含重组蛋白的细胞。涂布含氨苄西林(100μg/ml)的平板,30℃培养24h后挑选单克隆提取质粒,使用Nco I、EcoR I进行酶切鉴定,最终得到用于在TMEM18敲除中定向敲入eGFP的供体亚克隆质粒。我们将上述构建好的供体质粒和本实验室构建的用于TMEM18基因打靶的锌指核酸酶质粒共转染小鼠成肌细胞C2C12,48小时后,观察到了细胞的荧光,结果表明,锌指核酸酶有效地切断了 TMEM18,诱导同源重组,实现了 eGFP基因敲入。综上所述,我们构建的pheS-kana阴阳两性筛选系统可有效地用于BAC克隆的RED重组,为利用RED重组进行体外基因构建提供了一项新的技术。我们采用这种技术构建了在TMEM18中敲入eGFP的供体质粒,并在此基础上,建立了 TMEM18基因敲入eGFP的细胞。为该两性两筛选的组件在RED重组中应用以及TMEM18的功能的研究打下了基础。