[目的]研究同品系异体鼠间充质干细胞(Mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSC)移植对老年c57小鼠胸腺结构与功能的作用及机制,为临床老年性胸腺萎缩的治疗提供新方法和理论依据。[方法]1、衰老模型的筛选与评价:选用外购并在中国人民解放军联勤保障部队第920医院SPF级动物实验室内饲养至18月龄、体重在38±5g的雌性C57BL/6小鼠50只为衰老模型筛选鼠群。评价方法:外观观察毛发生长、颜色、精神、活动情况;随机抽取3只C57BL/6小鼠处死,采用大体解剖观察法观测胸腺大小;称重法测算胸腺/体重指数;常规胸腺组织切片,HE染色,光镜下观察胸腺组织结构;免疫荧光法分析胸腺皮隋质体积变化及淋巴细胞比例变化。采用免疫组织化学染色法分析衰老、自噬相关蛋白表达水平。2、mUCMSC的制备:选用中国人民解放军联勤保障部队第920医院SPF级动物实验室内饲养并妊娠21d的C57孕鼠,用颈椎脱臼法处死,无菌采集脐带,用眼科剪剪成1mm3大小的组织块,将组织块接种于10cm2培养皿底壁,待间充质干细胞爬出生长,融合率达80%后,用胰酶消化并收集原代mUCMSC,进一步传代扩增培养至第3代(p3)。对p4代mUCMSC,在倒置显微镜下观察培养期间的生长形态,采用流式细胞术分析mUCMSC的CD29、CD90和CD34阳性表达率,采用定向诱导分化试剂盒,按说明书的操作方法进行成脂、成骨和成软骨诱导分化,鉴定分化潜能。3、mUCMSC移植治疗:将前期筛选获得、符合胸腺衰老要求的C57小鼠随机分为治疗组、模型对照组,同时设2月龄C57小鼠为青年对照组,每组15只。对实验组,按1 × 107cells/kg的剂量,经尾静脉输注mUCMSC,每周2次(周一、四),连续3周;其余2组注射等体积生理盐水。常规饲养,每日记录小鼠活动情况,末次移植6W后处死各组小鼠,取材进行疗效和机制评价。4、mmUCMSC治疗的疗效评价方法:末次移植6周后,观察比较小鼠的外观毛发生长和颜色变化;称重后采用颈椎脱臼法处死,解剖观察胸腺大小、形态。取胸腺称重并计算体重比;采集胸腺组织,石蜡包埋、切片、HE染色,光镜下观察组织结构变化;采用免疫荧光法分析胸腺皮隋质体积变化及淋巴细胞比例变化。每组取3只小鼠的完整胸腺,用Ⅱ型胶原酶消化成单细胞悬液,然后用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群的比例变化。5、机制研究:对胸腺组织切片,采用化学标记抗体进行p16、p53、SOD1、becline1,LC3b,sirt1,sirt3免疫组织化学染色并分析相关蛋白分子表达水平变化。采用荧光标记抗体进行CK5、CK8、CD4和CD8染色,观测其表达水平变化。[结果]1、衰老模型评价:18月龄C57小鼠外观均表现为毛发部分发白、脱落,行动弛缓,精神欠佳,活动减少,体重在38±5g范围。18月龄老年鼠的胸腺指数为(0.39±0.21)×10-3,2月龄青年鼠的胸腺指数为(6.4±0.21)× 10-3,老年C57小鼠胸腺指数/青年C57小鼠胸腺指数=6.0%。组织结构观察可见18月龄小鼠胸腺腺体萎缩、皮髓质腺体样结构消失。免疫组织化学染色分析结果显示衰老蛋白表达量增加。2、mUCMSC的制备:接种于培养皿的脐带组织块,在培养至第2d时可见少量mUCMSC从组织块中沿周边爬出生长,细胞呈长梭形,并于第3d生长至细胞融合率达70%,消化收集原代mUCMSC后进行传带培养至第3代(P3),mUCMSC生长形态呈长梭形并呈旋涡状排列。P4代mUCMSC流式细胞术分析,CD29阳性率为99.6%,CD90阳性率为99.7%,CD34阳性率为0.109%,成脂诱导培养后油红0染色阳性,成骨诱导培养后茜素红染色阳性、成软骨诱导培养后阿辛蓝染色阳性。3、mUCMSC的疗效:(1)mUCMSC治疗后小鼠部分毛发转黑,背部脱落的毛发重新长出,对头、背、臀部毛发的平均灰度值行统计分析发现,治疗组的灰度值比模型对照组增加(p<0.01);(2)治疗组胸腺较模型对照组胸腺体积增大(p<0.05)。(3)胸腺指数平均数提高:治疗组/模型对照组=664%(p<0.01);(4)胸腺组织结构变化:治疗组小鼠胸腺腺体结构完整,具有明显腺体样结构,而模型对照组胸腺腺体样结构消失;(5)模型对照组和治疗组的胸腺CK5、CK8的表达水平均高于青年组(p<0.01);治疗组的胸腺组织中CK5表达水平高于模型对照组(p<0.01),而CK8表达水平有增高趋势,但差异不显著(p>0.05);(6)CD4+、CD8+T细胞比例变化:治疗组小鼠胸腺组织消化细胞中CD8+T细胞比例上升(p<0.001),表明mUCMSC治疗可能提高小鼠胸腺的CD8+T细胞输出功能。治疗组胸腺中CD4和CD8表达较模型对照组增强,且以CD8增加幅度为高。青年对照组小鼠胸腺以CD4+细胞为主,CD8+细胞数量较少。4、机制研究:(1)衰老相关蛋白表达变化:对比胸腺组织免疫组化结果我们发现p53、P16蛋白活性在青年对照组、治疗组、模型对照组中的表达呈上升趋势,但差异不显著(p>0.05)。SOD1、Sirt1、Sirt3蛋白活性在青年对照组最低,mUCMSC治疗组最高,模型对照组处于中间位置(p>0.05)。(2)自噬相关蛋白表达变化:LC3b活性在青年对照组最低,治疗组最高,模型对照组处于中间位置。青年对照组/治疗组=15.4%(p<0.01);青年对照组/模型对照组=34.3%(p<0.05);模型对照组/治疗组=45.1%(p>0.05);becline1活性在青年对照组最低,治疗组最高,模型对照组处于中间位置。青年对照组/治疗组=24.0%(p<0.05);青年对照组/模型对照组=34.4%(p<0.05);模型对照组/治疗组=69.8%(p>0.05);P62活性在模型对照组最低,治疗组最高,青年对照组处于中间位置。青年对照组/治疗组=87.0%(p>0.05);青年对照组/模型对照组=150.6%(p>0.05);模型对照组/治疗组=57.7%(p>0.05)。[结论]1、18月龄C57小鼠的毛色、精神、活动呈衰老状态,胸腺萎缩、结构紊乱,T细胞输出功能下降,符合胸腺衰老模型要求;2、制备获得生长特性、免疫表型、分化潜能符合UCMSC标准的C57小鼠mUCMSC。3、mUCMSC治疗可促进衰老小鼠毛发再生,促使部分毛发转黑,再生胸腺的结构和以CD8+T细胞为主的免疫输出功能。4、mUCMSC通过下调衰老基因p53、p16、上调SOD1、Sirt1、Sirt3基因的表达抑制胸腺衰老进程和促进胸腺组织的结构与功能再生,对自噬相关基因LC3b、becline1、P62表达有促进作用,但其机制需要进一步研究。