果桑资源的开发利用已成为蚕桑产业发展的新型经济增长点,然而桑椹菌核病(Mulberry fruit sclerotiniosis)是制约果桑产业健康发展的重要因素之一。桑椹菌核病主要有肥大性、缩小性及小粒性三种病症,其中核地杖菌(Scleromitrula shiraiana)是引发桑椹缩小性菌核病的主要病原真菌。本研究在前期分离获得桑椹缩小性菌核病菌Scleromitrula shiraiana SXSG-5菌株的基础上,通过全面研究该菌株致病相关的生物学特性,解析其全基因组序列,探究与该菌株抗逆生长、致病性相关的基因及产物,为安全高效地防控桑椹缩小性菌核病奠定研究基础与作用靶标。本研究主要取得了以下结果:1、S.shiraiana SXSG-5菌株生物学特性研究为全面掌握S.shiraiana SXSG-5菌株的生物学特性,本研究观测了该菌株的生活史,并检测了该菌株的抗逆性及药敏性。通过对S.shiraiana SXSG-5菌株无性生殖及有性生殖阶段的系统观察,掌握该菌株生活史。无性生殖阶段的观测结果表明,S.shiraiana SXSG-5菌株在PDA上培养45天时,该菌株的营养菌丝体大量形成膨大褶皱产孢结构,且凹圆体状的分生孢子开始从中脱落;培养60天时,该菌株的产孢结构几乎全部解体,产生大量成熟的近圆体状分生孢子(直径约为0.7～2.8μm)。同时,有性生殖阶段的观测结果表明,人工培养该病原菌菌核1个月后(温度18±2℃,相对湿度>90%,12 h光照与12 h黑暗交替培养),菌核萌发形成灰褐色子实体,且子实体头部为梭形;待成熟子实体释放子囊孢子后,褶纹黑化,萎缩倒伏。此外,梭状子实体镜检结果显示,子实层淡褐色,呈扫帚状,基底上着生棍棒状子囊;子囊内含8个并排一列或不规则两列的子囊孢子,子囊孢子为椭圆形(大小约为1.7～2.8×4.7～10.6μm)。进一步采用生长速率法检测了S.shiraiana SXSG-5菌株的氧化应激性和渗透压敏感性,掌握该菌株的抗逆生长性能。利用不同浓度过氧化氢检测该菌株的氧化应激性能。结果显示,随着过氧化氢浓度升高,S.shiraiana SXSG-5菌株的菌落生长受到明显抑制,当过氧化氢浓度为6 mmol/L时,其抑菌率达到94.26%。利用不同浓度氯化钠、蔗糖和甘油检测该菌株对无机盐、糖类及脂类的渗透压敏感性。结果表明,氯化钠对S.shiraiana SXSG-5菌株的菌丝生长具有一定影响,当浓度为4 g/L,其抑菌率为48.02%;S.shiraiana SXSG-5菌株对高浓度蔗糖具有一定的耐受力,当蔗糖浓度为200 g/L,其抑菌率仅为22.44%;而S.shiraiana SXSG-5菌株对高浓度甘油敏感,当甘油浓度为200 g/L时,其抑菌率高达86.07%。氧化应激性及渗透压敏感性检测结果表明,活性氧及高渗透压甘油胁迫对S.shiraiana SXSG-5菌株的菌丝生长具有显著抑制作用。此外,采用生长速率法检测了S.shiraiana SXSG-5菌株对不同农用杀菌剂、抗生素及除草剂的药敏性,以利于后续病害防控选择优良药剂。结果显示,0.6ug/mL的多菌灵、百菌清及代森锰锌对S.shiraiana SXSG-5菌株的菌落生长抑菌率分别为100%、95.71%、54.99%;当放线菌酮、灰黄霉素、制霉素、潮霉素、遗传霉素浓度等于或高于25μg/m L,5种抗生素均能完全抑制S.shiraiana SXSG-5菌株的菌丝生长;除草剂草铵磷对S.shiraiana SXSG-5菌株的菌丝生长抑菌率随着用药浓度的提高而略有提升,当其浓度为50μg/m L,其抑菌率仅为46.06%。药敏性试验结果表明农用杀菌剂多菌灵和百菌清、常用抗生素对S.shiraiana SXSG-5菌株的菌丝生长具有较好抑制作用,除草剂草铵膦对其亦具有一定的抑制作用。2、S.shiraiana SXSG-5菌株致病性能测定为探究S.shiraiana SXSG-5菌株分生孢子的致病性能,本研究利用S.shiraiana SXSG-5菌株分生孢子悬浮液,在田间侵染桑花。试验结果显示,随着桑果的成熟,侵染34天后,孢子悬浮液处理组部分桑果染病,呈灰黑腐状且易脱落,对照组未见染病桑果;进而从染病桑果中分离纯化获得19株真菌,其中11株与核地杖菌S.shiraiana相似度高达99%,且基于ITS系统发育分析显示,这11株真菌均与S.shiraiana SXSG-5菌株处于发育树同一分支,表明S.shiraiana SXSG-5菌株的分生孢子对桑果(花期侵染)具有致病性。同时,S.shiraiana SXSG-5菌株的致病因子检测结果显示,该菌株可分泌致病物质草酸、纤维素酶、果胶酶及蛋白酶;病理组织观察亦显示,病椹果肉组织腐烂,呈黄褐色,皮层受损,内部存在大量菌丝体且有大量孢子分布在果肉组织内外。由此表明,S.shiraiana SXSG-5菌株可能通过产生降解酶类水解宿主胞壁及胞内内含物,并产生毒素草酸酸化宿主细胞环境,增强对宿主植物的侵染能力。3、S.shiraiana SXSG-5菌株全基因组解析为深入探究S.shiraiana SXSG-5菌株抗逆生长及致病力相关的分子机制,本研究通过解析S.shiraiana SXSG-5菌株的基因组信息,并利用比较基因组学挖掘其致病相关基因。S.shiraiana SXSG-5菌株的基因组组分分析结果显示,该菌株基因组大小为36.71 Mb,GC含量为39.57%,包含32个基因支架;该菌株基因组中预测了10758个编码蛋白基因,分别编码694种分泌蛋白和10064种非分泌蛋白;该菌株基因组中共鉴定出16392 bp重复序列,主要包括短散在重复序列(SINE)、长散在重复序列(LINE)、长末端重复序列(LTR),其中主要类型为LINE,占基因组的0.03%;该菌株基因组中的次生代谢产物基因簇主要包含13个I型聚酮合酶(PKS)簇,1个III型聚酮合酶(PKS)簇,7个非核糖体肽合成酶(NRPS)簇,2个萜烯簇,4个吲哚簇和10个其它基因簇。进而,对S.shiraiana SXSG-5菌株进行功能基因注释,碳水化合物活性酶(CAZy)数据库注释结果显示,S.shiraiana SXSG-5菌株基因组中CAZy相关基因主要包括473个糖苷水解酶类(GH),373个糖苷转移酶类(GT),以及230个碳水化合物结合模块(CBM);病原与宿主互作(PHI)数据库注释结果显示,该菌株具有10个与酸性蛋白酶相关的基因,4个与果胶裂解酶相关的基因,5个与黑色素合成相关的基因,2个与草酰乙酸乙酰水解酶相关的基因,3个与氧化应激性相关的基因,8个与高渗透压甘油信号通路相关的基因。同时,对S.shiraiana SXSG-5菌株进行比较基因组学分析,基于单拷贝同源基因的进化分析显示,S.shiraiana SXSG-5与Sclerotinia sclerotiorum、Botry cinerea处于进化树的最小分支,遗传距离最近;且利用GO(Gene Ontology)数据库注释S.shiraiana SXSG-5与S.sclerotiorum的基因功能,结果显示,S.shiraiana SXSG-5与S.sclerotiorum的基因功能分类相似;同时,病原与宿主互作(PHI)数据库比对结果显示S.shiraiana SXSG-5菌株的基因位点SXSG-5 02856、SXSG-5 04111、SXSG-5 03096、SXSG-5 06008分别与S.sclerotiorum的Shk1、Ss-pth2、PAC1、Ss-oah1具有高度同源性,推测这4个基因位点分别与编码组氨酸激酶、过氧化物酶、转录因子及草酰乙酸乙酰水解酶的生物过程相关,分别参与该菌株的高渗透甘油压胁迫、菌核形成、pH调控及草酸生物合成。基因组及功能基因注释结果表明,该菌株具有调控高渗透压甘油胁迫及氧化应激的相关基因,并具有果胶酶、蛋白酶等水解酶类,以及草酸等致病物质合成的相关基因。基因组分析结果与该菌株抗逆生长及致病物质的检测结果一致,这为后续分子机制的深入探究提供了重要靶标。综上所述,本研究通过对S.shiraiana SXSG-5菌株的生活史观测、抗逆性能检测及药敏性测试,全面研究了该菌株的生物学特性;并对S.shiraiana SXSG-5菌株进行田间致病试验、病理组织观察和致病物质检测,探究了该菌株的致病力;进而,对S.shiraiana SXSG-5菌株进行全基因组测序,通过其基因组信息、功能基因注释及比较基因组学分析,初步探究了S.shiraiana SXSG-5菌株的致病相关分子机制。本研究取得的结果将为全面揭示桑椹核地杖菌致病分子机制及高效防控桑椹缩小性菌核病提供理论支撑和研究靶点。