角膜环状皮样瘤(Ring Dermoid of Cornea，RDC，MIM180550)是一种非常罕见的常染色体显性遗传疾病。该病主要影响患者视力，患者可出现散光、斜视和弱视等，严重的甚至可以导致失明。研究者们在一个含有4代共55人，其中17人为患者的大家系中检测到PITX2基因中的一个错义突变G185A，该突变导致其编码蛋白第62位上的氨基酸从精氨酸变为组氨酸，由此确定这个突变为角膜环状皮样瘤的致病原因。 PITX2编码的蛋白为一种同源异型盒蛋白，属于Paired-Bicoied同型盒蛋白家族。作为转录因子，PITX2在个体不对称发育中有重要的作用。目前已发现该基因的不同突变可以导致不同的疾病的发生，如Axenfeld-Rieger综合症(ARS)，Peters异常[10]以及Iridogoniodysg-enesis综合症(IGDS)等。PITX2导致这些疾病的机制还不很清楚，本论文中从以下两个方面对PITX2 R62H突变体的功能进行研究： 首先，PITX2是一个转录因子。对转录因子来说，DNA结合和能力对其生理功能有极其重要的作用，因此大量的研究者都致力于研究突变对该蛋白质DNA结合能力的影响。突变R62H正好位于一个高度保守，普遍认为与DNA结合能力密切相关的结构域：同源异型盒，因此有理由去研究该突变是否改变了其蛋白质的DNA结合能力。 其次，Wnt/β-Catenin信号传导通路可以诱导PITX2基因迅速表达并稳定其mRNA，PITX2本身也参与到该信号通路调节其他一些mRNA的稳定性。PITX2通过影响Cyclin D1，CyclinD2等基因的表达而调节细胞的增殖分化等行为。考虑到Wnt/β-Catenin信号传导通路在个体发育中的地位，突变是否改变蛋白质在信号传导中的行为也是一个值得探讨的方向。 电泳迁移率变化分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)可以用来研究蛋白质-DNA相互作用及其相互作用的改变。将构建好的PITX2野生型和突变体原核表达载体转染到BL21细胞中，诱导表达后纯化蛋白质即可用于EMSA实验。为研究其转录激活能力的变化，将相应的真核表达载体转染至Hela细胞后，提取细胞总RNA，经逆转录PCR得到总cDNA后，采用实时荧光定量PCR检测细胞中β-Catenin和Cyclin D1的相对表达量，用以评估PITX2突变对其转录激活能力的影响。 与其他一些PITX2的突变体不同，本课题中的实验结果显示突变体R62H拥有基本正常的DNA结合能力；而实时荧光定量PCR结果则显示，与转染野生型PITX2的Hela细胞相比，转染PITX2 R62H突变体的Hela细胞中的β-Catenin和Cyclin D1含量具有显著的变化。