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粘虫Mythimna separata(Walker)隶属于昆虫纲(Insecta)鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)。粘虫严重危害禾本科粮食作物安全,在我国为害有两千多年的历史。粘虫间歇性爆发对作物危害极大,现阶段针对粘虫的防治主要以化学防治为主,滥用农药不仅导致虫体抗药性产生,还会破坏生态,严重威胁人类安全。RNAi技术在害虫防治方面具有巨大的潜力。近年来,基于植物病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)原理上形成了一种寄主植物介导昆虫RNAi技术,该技术成为现阶段农作物抗虫基因工程的热点之一,但在鳞翅目昆虫中的研究报道较少。以几丁质合酶A(chitin synthase A,CHSA)为靶标基因,探讨寄主植物介导粘虫RNAi的有效性,可为利用RNAi技术进行害虫防治提供基础数据,同时可以丰富昆虫几丁质合酶的生理功能相关知识。本实验利用RT-q PCR技术,建立了粘虫幼虫CHSA时空表达模式;随后借鉴植物VIGS原理,以烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)为载体,以CHSA为靶标基因,以玉米(郑单985)为寄主植物,建立了寄主植物介导粘虫RNAi技术体系并探讨了CHSA的生理功能。1.粘虫幼虫CHSA基因的时空表达模式。根据NCBI中提供的粘虫CHSA基因c DNA序列(登录号:AOZ56906),应用Primer-BLAST在线软件设计实时荧光定量引物。利用RT-q PCR技术,以β-actin为内参基因检测CHSA基因在5龄幼虫7种组织(头部、表皮、前肠、中肠、后肠、脂肪体和马氏管)和各个龄期表皮中的表达情况。结果显示,CHSA基因在粘虫7种组织中均有表达,表皮中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01),头部仅次于表皮,其他组织的表达量较低,其中后肠和脂肪体的表达量显著高于前肠、中肠和马氏管(P<0.05);CHSA基因在1-6龄幼虫表皮中均有表达,在3龄、4龄和5龄时表达量显著高于1龄、2龄和6龄(P<0.05),5龄的表达量最高。结果表明,CHSA基因在外胚层形成的表皮中特异性表达,参与表皮几丁质的形成。2.玉米介导粘虫RNAi体系的建立。利用Primer-BLAST在线软件在粘虫CHSA基因的编码区设计扩增RNAi靶标片段引物,分别在上下游引物的5’端加上Kpn I和Bam HI限制性内切酶位点序列,利用PCR技术扩增RNAi的靶标片段,通过Kpn I和Bam HI双酶切后,将其分别与pTRV2和pTRV2GFP(携带绿色荧光蛋白的pTRV2质粒,便于利用GFP荧光筛选侵染成功的植株)质粒重组。通过农杆菌GV3101介导,把含重组质粒pTRV2-CHSA、pTRV2GFP-CHSA和pTRV2-GFP(实验室提供)的农杆菌GV3101菌液和含有pTRV1质粒的农杆菌GV3101菌液1:1混匀,利用真空渗透转化玉米胚芽。在DNA水平和RNA水平分别检测重组质粒转化和CHSA-ds RNA与GFP-ds RNA的表达情况。结果显示,在出芽后第15天的玉米苗中可检测到重组质粒DNA、CHSA-ds RNA及GFP-ds RNA。随后将检测含有CHSA-ds RNA、GFP-ds RNA的玉米苗饲喂粘虫幼虫进行沉默效果观察。选取3株转化成功的玉米苗进行田间实验,60天后在顶叶和花粉中均可以检测到重组质粒DNA,由此推测该质粒可以遗传给下一代。使用GFP荧光检测pTRV2GFP-CHSA重组质粒转化的出土后第5天玉米苗,有明显的绿色荧光斑点,证明pTRV2GFP可用作工程载体。3.粘虫RNAi沉默效果鉴定。实验设置空白对照、阴性对照(pTRV2、pTRV2-GFP)和阳性对照(pTRV2-CHSA、pTRV2GFP-CHSA),每个对照组3个生物学重复,每个重复处理6-10头同一批3龄第二天试虫。通过RT-q PCR对CHSA基因沉默效率进行鉴定。结果显示,对照组(空白对照、pTRV2和pTRV2-GFP)之间CHSA基因的m RNA水平没有显著差异(P>0.05),实验组CHSA基因的m RNA水平极显著低于对照组(P<0.01),实验组(pTRV2-CHSA和pTRV2GFP-CHSA)之间CHSA基因的m RNA水平不存在显著差异(P>0.05)。由此表明,饲喂表达CHSA-ds RNA的玉米苗可以抑制粘虫体内的CHSA基因的表达。观察和记录粘虫蜕皮后头壳宽度、体长、5龄第2天粪便干重、发育历期和死亡率。结果显示,对照组和实验组之间头壳宽度和粪便干重没有显著性差异(p>0.05),实验组的体长显著短于对照组(p>0.05),实验组的发育历期显著长于对照组(p<0.05),实验组的死亡率(pTRV2-CHSA为53.3%、pTRV2GFP-CHSA为46.7%)显著高于对照组的死亡率(p>0.05)。死亡个体表现为不能形成新表皮的角质层。综上所述,本实验以粘虫幼虫为研究对象,基于植物VIGS技术原理,建立了TRV病毒载体介导玉米表达粘虫靶基因ds RNA体系,通过靶标基因CHSA来验证了该RNAi技术的可行性以及丰富了对粘虫CHSA基因功能的认识,为以后研究粘虫基因功能研究提供了一个新的思路,同时为害虫防治的提供了一定的基础资料。