类固醇激素是一类内分泌干扰物,其在极低的水平就能导致生物体的性别比例失调、生殖能力下降和引起癌症等一些不利影响,因此环境中类固醇激素污染问题引起了研究者们的广泛关注。目前国内外学者在利用微生物降解类固醇激素方面做了大量的工作主要包括类固醇激素降解菌的分离、鉴别、降解条件的优化、降解动力学等的研究,但传统的类固醇转化细菌生长速度较缓慢、培养环境要求高,不利于工业大规模培养,因而限制了其环境修复的应用。基因工程菌株可以有效避免这些缺点,现阶段利用基因工程菌降解类固醇激素成为人们解决环境污染的热点问题。本研究基于基因组测序的方法从Rhodococcus equi DSSKP-R-001（简称R.D-001）中注释到5个类固醇降解关键酶3-酮-类固醇-?1-脱氢酶（3-Ketsteroid-Δ1-dehase,Kst D[EC1.3.99.4]）,通过基因克隆的方法构建基因工程菌。通过高效液相色谱法检测基因工程菌降解类固醇激素的能力,并通过生物信息学的方法对该蛋白质进行理化性质分析、结构预测以及其保守结构域分析,从分子水平上进一步解释该酶的基本性能。本文的主要结果如下:1.从红球菌R.D-001中选择大小分别为1539 bp、1713 bp、1539 bp、1692 bp、1689bp的5个kstd基因进行克隆,并构建重组质粒,将其在大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达,构建K1、K2、K3、K4、K5基因重组菌。基因重组菌经诱导剂（IPTG）诱导后均可成功获得大小为61 k Da、60 k Da、54 k Da、60 k Da、60 k Da的目的蛋白。2.构建的5株基因工程菌均可以把4-雄烯二酮（AD）、孕酮（PGT）、睾酮（TTR）以及17β-雌二醇（E2）作为唯一的生长碳源,且对AD和TTR的降解率均在90%以上,对E2和PGT降解率均大于30%。其中K1、K4菌株对AD降解效果最佳,K2、K3、K5对TTR的降解效果最佳,对PGT的降解效率均最低。其中5株重组菌中降解效果最好的是K2菌株,且具有广谱适应性,该菌在72 h的降解实验中对AD的降解率达到95.66%,对TTR降解率达到99.02%,对PGT降解率达到46.54%,对E2降解率到达50.22%。RT-PCR实验表明,kstd2基因是诱导性表达的,且在不同类固醇底物的诱导下,m RNA相对表达水平有所差异,其中kstd2基因在AD诱导下m RNA的相对表达水平最高,其次是E2对kstd2的诱导表达。同时K2菌株显示出对AD和睾酮的偏爱,其次是雌二醇,最后是孕酮,进一步表明基因工程菌株在不同类固醇激素降解中表现出选择偏好性。3.使用生物信息学在线软件分析表明,Kst D2原子总数为8468,分子式为C2679H4190N764O817S18,编码kstd2的基因序列长度为1713 bp,可以编码568个氨基酸,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA。该酶无信号肽和跨膜区,是一种亲水可溶性蛋白,属于重要的胞内氧化还原酶。预测其理论等电点（PI）为5.74,理论分子量为60.75k Da。选取具有类固醇降解功能的20个氨基酸序列构建了系统发育树,并选取亲缘关系较近的蛋白质进行多序列比对,发现该蛋白属于3-酮类固醇-Δ1-脱氢酶。二级结构预测结构显示该酶的主要结构是α-螺旋和无规卷曲。使用菌株R.erythropolis SQ1的4c3y.1A晶体结构进行同源建模,Kst D蛋白与模板4c3y.1A比对的相似性为35.90%,推测Kst D2蛋白的三级结构可能是同源四聚体。这些结果为以后突变底物结合位点的专一性位点残基的深入研究提供理论基础。以上研究结果表明,基因工程菌K2在短时间内对类固醇激素具备较强的降解能力,具备较强降解类固醇激素的应用潜力,本研究将有助于推进红球菌R.D-001中类固醇激素降解分子机制的研究,为类固醇代谢途径的完善提供基础,并为利用基因工程菌降解环境中类固醇激素的成功应用提供一定的理论指导。