随着人们对生命科学认知的需求,多光子荧光显微术已经成为一种重要的生物成像技术。多光子激发需要同时吸收多个光子来完成电子跃迁,是一个非线性光学过程,因此它的产生需要很高的激发光强(＞109w/cm2)。近年来出现的超短脉冲激光器,如皮秒激光器、飞秒激光器具有较高的峰值强度和较低的平均功率,是多光子荧光显微术的理想光源。多光子激发仅发生在几何焦点附近光强较高的区域(焦点外的光强较低不足以激发多光子荧光),因此多光子荧光显微术天然地具有三维层析能力,同时也大大减弱了焦点之外区域荧光分子的光漂白和光损伤。此外,多光子荧光显微术通常以近红外光作为激发光源,与可见光相比,近红外光在生物组织中的散射和吸收小,因此具有显著增强的穿透能力。　　 尽管多光子荧光显微术具有上述优点,但它仍然存在一些局限性。例如,在对高散射生物组织成像时,激发光强随深度的增加呈指数衰减,为了在更深处维持同样的荧光信号强度,需要按指数不断增加激发光强度。深度越深,所需要的激发光强就越高。当激发光强超过一定的阈值时,一方面会导致焦点之外区域背景荧光噪声的产生从而降低信噪比,另一方面也加剧了样品表面荧光分子的光漂白和光损伤。因此,通过增加光强并不能无限制地提高成像深度,焦点外的背景荧光噪声从根本上限制了成像深度的进一步提高。如何突破现有多光子成像技术在层析深度方面的不足是该研究领域的一大难点,本文主要致力于寻求一些全新的成像方案来解决上述问题。　　 此外,光流控芯片因具有低消耗、高效率和高灵敏度等传统生化分析系统无可比拟的优点,目前已经在生物医学领域掀起了一场重大革命。利用光流器件实现显微镜系统中的一些复杂功能,将非常有益于成像系统的微型化和集成化,毫无疑问会推动更多的生物医学应用。为此,本论文也特别演示了微光学、微流体元件在显微成像系统中的应用。　　 本文主要有以下几个创新点:　　 1首次将飞秒激光光学参量放大器(OPA)作为激发光源,应用于双光子荧光显微成像系统。实验中对比了飞秒振荡器(800 nm)、飞秒放大器(800 nm)以及OPA(1240nm)三种激发光源在散射体中的成像深度,结果表明使用长波长激发光源能够大大地提高成像深度。该实验证实了OPA作为非线性荧光显微术的激发光源的可行性。　　 2首次提出一种同轴双色双光子荧光显微成像方案。本方案采用外环内圆的入射模式,两入射光束仅在焦点区域实现空间重叠,可有效避免焦点外的背景荧光。利用蒙特卡罗模拟证明:与普通的双光子成像相比,该方案在对高散射生物组织成像时具有更高的信噪比,能够有效提高层析深度。该方案是一种有望突破现有双光子成像层析深度的全新技术方案。　　 3首次利用飞秒激光再生放大器作为激发光源,从实验上观测到了吲哚(氨基酸重要组分)的双色双光子荧光信号。该实验证实了飞秒放大器作为双色双光子荧光显微成像术的激发光源的可行性。　　 4首次将飞秒激光直写的微透镜作为成像物镜,用于双光子荧光成像系统,并对生物组织成像。实验中测量的横向和纵向分辨率分别为1.6μm和11.1μm,此外,该实验还展示了微透镜对植物叶子组织的成像质量与5倍商用物镜相当。此实验初步演示了飞秒激光微纳加工技术制备的微透镜在小型化非线性荧光显微镜(如双光子内窥镜)上具有潜在的应用价值。　　 5利用飞秒激光直写技术将微光学透镜和微流体通道集成在石英玻璃芯片中,并演示了微透镜对微通道中的物体具有5倍放大镜的功能。该集成器件在芯片实验室中具有潜在的应用价值。