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急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是严重急性呼吸衰竭的主要原因,其特点为肺泡渗透性增加及持续、严重的低氧血症。目前除呼吸及生命支持治疗外临床缺乏有效的手段,ARDS的发生与患者高死亡率相关,是危重症患者主要死亡原因之一。近几十年,在严重ARDS患者中保护性机械通气策略、限制性静脉液体管理、俯卧位通气以及体外膜肺氧合(ECOM)等抢救策略在临床治疗取得了极大的进步,但自1994年以来ARDS的总体死亡率仍持续在40%左右。先前众多针对ARDS炎症过程的基础研究,其临床抗炎疗效并不理想,免疫调控成为近年研究的新方向。Th17细胞作为近些年发现的一种新型不同于Th1和Th2的CD4+效应T细胞,兼具固有免疫应答和适应性免疫应答的特征,并有募集中性粒细胞的作用,Th17细胞介导的免疫应答可能是ARDS潜在的炎症调控机制。RORγt作为Th17细胞特异性核转录因子,其转录活性决定了Th17细胞的分化。转录辅因子p300/CBP作为主要的组蛋白乙酰化转移酶可通过其乙酰化核转录因子以调节转录活性,如p53,Foxp3,RORγt,通过乙酰化以改变其稳定性,亚细胞定位和DNA结合能力。新近发现β-catenin分子核内积累可促进RORγt的表达,其可能是调控Th17细胞分化的重要上游分子。有报道p300/CBP通过其乙酰化作用参与wnt/β-catenin及STAT3-RORγt通路激活的调节。目前p300/CBP分子在ARDS中所起的作用及其是否经β-catenin或RORγt参与Th17细胞分化的调节国内外尚无研究文献报道。而p300及HDAC分子抑制剂在肿瘤及慢性气道炎症疾病领域的应用已有大量研究证实其良好的临床应用前景,基于p300/CBP对于ARDS的作用机制尚不清楚,为此我们设计了此课题。目的:明确p300/CBP分子在ARDS中的表达特征,通过p300及HDAC抑制剂对ALI动物模型的干预探究其在ARDS炎症过程中对Th17细胞分化的调控作用及可能机制。方法:1)通过RT-PCR方法检测ARDS患者及健康体检者外周血样本分离出的单个核细胞(PBMC)中p300、CBP、RORγt、Foxp3基因的m RNA的表达;采用ELISA方法测定外周血浆中炎性因子IL-17、IL-6、IL-10的浓度。同时收集研究对象人口统计学和临床检验等基线资料,记录急性生理和慢性健康(APACHEⅡ)评分、序贯器官衰竭(SOFA)评分。主要结局定义为随访28天时ICU或者院内病死率。2)通过气管内注入LPS方法对40只小鼠建立ARDS动物模型,并行肺组织湿干重比测定及HE染色进行肺损伤半定量评分。40只小鼠分为NS+DMSO、LPS+DMSO、LPS+C646、LPS+TSA4组。两干预组在建模后腹腔分别注入p300特异性阻滞剂C646及HADC阻滞剂TSA,四组均在建模用药24小时后处死小鼠,取小鼠肺组织及BALF样本。通过ELISA测定肺组织及BALF中IL-17、IL-6、TGF-β的浓度;IHC观察p300、CBP及RORγt蛋白在肺组织的表达情况;western-blot检测小鼠肺组织p300、RORγt蛋白水平;RT-PCR检测p300、RORγt的m RNA表达。结果:(1)与健康对照组比较,急性期ARDS患者p300、CBP、RORγt m RNA及IL-17、IL-6表达水平显著增加(P<0.05),而Foxp3 m RNA及血浆IL-10表达组间无显著差异。(2)亚组分析显示死亡组的p300、CBP m RNA及IL-6水平显著高于存活者,而Foxp3 m RNA表达在死亡组显著降低(P<0.05);另发现RORγt m RNA表达水平在感染诱发ARDS亚组中明显高于非感染ARDS患者。(3)参数与非参数相关性分析结果显示急性期ARDS患者外周血p300 m RNA的表达与血浆IL-6、IL-17水平呈线性相关,相关系数分别为0.4522和0.3576(P<0.05),并与RORγt、CBP m RNA表达具有等级相关,相关系数为0.3382和0.3042(P<0.05);而CBP m RNA的表达除与p300具有相关外与其他检测因子不具有相关性。(4)Logistic回归分析提示IL-6、p300、CBP可能为预后相关指标,再进一步纳入基线资料、生存时间经Cox风险模型筛选出年龄,p300及CBP m RNA的表达可能为预测ARDS患者预后的影响因素。(5)IHC方法检测p300、RORγt、CBP在ALI肺组织中主要表达于肺间质的白细胞和少数肺泡上皮细胞,支气管上皮细胞极少发现;且主要定位于胞核,较少定位于胞浆。染色强度及百分比发现所有LPS干预组p300、RORγt、CBP染色均较NS对照组高。p300特异性抑制剂C646组显示出更低的p300和RORγt染色,而CBP染色强度在模型组中均较p300、RORγt弱,三模型组CBP染色无显著差异。结果提示p300受抑可能影响RORγt表达。(6)ELISA、WB及RT-PCR结果提示C646可以显著抑制p300蛋白水平,并引起IL-17,RORγt m RNA及其蛋白水平下降,改善急性肺损伤病理评分,显示其肺保护作用。HDAC抑制剂TSA表现出与之相反的作用,但作用强度不如C646明显。结论:p300/CBP在ARDS急性期呈高表达,尤其p300的表达与RORγt、IL-17的水平呈正相关且可能为ARDS患者的预后因素之一。进一步动物模型结果显示p300通过正向调节核转录因子RORγt促进Th17细胞分化,其特异性抑制剂C646显示出其对ALI的保护作用。