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脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)作为机体胆固醇醇代谢过程中最重要的中间产物,可直接或在靶器官相关酶系的转化下而间接发挥其广泛的生物学作用。研究表明,DHEA降低机体脂肪沉积的作用已较为肯定,但其具体的生物学机制尚不明确。机体脂肪的沉积取决于脂肪细胞数量的增加和脂肪细胞的肥大。已有对DHEA调节脂代谢的研究主要集中在与脂肪代谢直接相关的因子方面,往往忽视了其对细胞生物学特性的影响。因此,本文以鸡胚原代肝细胞为研究对象,在分析DHEA对鸡胚原代肝细胞脂滴沉积和脂代谢相关因子的影响基础之上,探讨DHEA对鸡胚原代肝细胞增殖、细胞周期和线粒体功能的影响,以期为从细胞生物学特性的角度阐明DHEA调节机体脂肪沉积的机制。研究结果将为揭示DHEA的生物学功能及其作用机制提供重要的理论依据,同时对提高畜禽产品品质及营养代谢病的防控也具有一定的指导性意义。1.DHEA对鸡胚原代肝细胞脂滴沉积的影响及其机制本实验以鸡胚原代肝细胞为研究对象,探讨不同浓度DHEA对鸡胚原代肝细胞脂沉积和脂肪代谢关键因子mRNA表达的影响,以期阐明DHEA对鸡胚原代肝细胞脂滴沉积的影响及其机制。鸡胚原代肝细胞用含终浓度分别为0μmol·L-1、0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、50 μmol·I-1 和 100 μmol·L-1 的 DHEA 培养液分别孵育 1 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h后,收集细胞。采用MTT法检测细胞相对活力,试剂盒测定甘油三酯(TG)含量,油红染色检测脂滴沉积,Real-time PCR检測鸡胚原代肝细胞脂肪合成关键因子ACC和FAS、脂肪分解关键因子CPT-I mRNA及相关转录因子PPARα、SRE P-1c 和 AMPK的 mRNA 表达水平。结果表明,0.1 μmol·L-1～50 μmol·L-1的DHEA处理1-48 h均可显著增加鸡胚原代肝细胞活力(P<0.05)。0.1～100 μmol·L-1的DHEA处理1～48 h,可显著降低鸡胚原代肝细胞中TG含量(P<0.05)。油红染色分析表明,0.1～100 μμmol L-1的DHEA处理可显著降低鸡胚原代肝细胞中脂滴数目和脂滴总面积(P<0.05)。脂代谢相关基因分析结果表明,0.1～100 μmol·L-1的DHEA处理能极显著降低FAS、ACC和SREBP-1c mRNA的表达水平,显著升高CPT-ImRNA的表达(P<0.05)。与对照相比,PPARα mRNA的表达水平在50μmol·L-1和1OOμmol·L-1的DHEA处理组显著升高(P<0.05)。0.1～100μmol ·L-1的DHEA处理可显著升高AMPKαl和AMPKα2mRNA的表达水平(P<0.01),但不同浓度DHEA处理组对AMPKβ1、AMPKβ2、AMPKγ1、AMPKγ2和AMPKγ3mRNA的表达水平并无显著影响(P>0.05)。以上结果提示,DHEA处理可通过抑制脂肪合成相关基因的表达、增强脂肪分解相关基因的表达,从而抑制鸡胚原代肝细胞内脂滴的沉积,且其机制可能与DHAE增强AMPKα的表达有关。2.DHEA对鸡胚原代肝细胞增殖特性的影响本实验以鸡胚原代肝细胞为研究对象,探讨DHEA对鸡胚原代肝细胞增殖特性、细胞周期和周期相关因子表达的影响,以期从细胞增殖特性的角度阐明DHEA调节鸡胚原代肝细胞脂肪沉积的影响及其机制。选用终浓度分别为0μμmol·L-1、0.1 μμmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μμmol.L-1、50 μmol·L-1 和 100 μmol·L-1 的 DHEA 培养液孵育鸡胚原代肝细胞24 h。采用EDU法检测鸡胚原代肝细胞的增殖,流式细胞术分析鸡胚原代肝细胞细胞周期各期比例,Real-timePCR检测细胞周期因子CyclinA、CyclinB和CDK2 mRNA表达水平。结果表明,与对照组相比,1～100μomo·L-1的DHEA处理组能明显降低鸡胚原代肝细胞的总细胞数和新增殖细胞《数,且呈现出明显的剂量效应。流式细胞术分析结果表明,1～100 μmol·L-1的DHEA处理可极显著增加S期细胞比例(P<0.01),极显著降低G2/M期细胞比例(P<0.01)。与对照组相比,1～100μmol·L-1的DHEA处理组能显著降低CyclinAmRNA的表达水平(P<0.05),1 μmol·L-1、50μmol.I-1 和 100 μmol·L-1 DHEA 处理组显著降低 CDK2 mRNA 的表达水平(P<0.05),但不同浓度DHEA处理组对CyclinB mRNA表达水平无显著性影响(P>0.05)。以上结果提示,DHEA处理可通过降低CyclinA和CDK2mRNA的表达水平,使细胞阻滞于S期,从而抑制鸡胚原代肝细胞增殖,进而降低鸡胚原代肝细胞内脂滴的数量和脂滴总面积。3.DHEA对鸡胚原代肝细胞线粒体功能的影响本实验以鸡胚原代肝细胞为研究对象,探讨DHEA对鸡胚原代肝细胞线粒体数量、膜电位和琥珀酸脱氩酶活性的影响,旨在从调节线粒体功能的角度阐明DHEA对鸡胚原代肝细胞脂肪沉积的影响。选用含终浓度分别为0 μumol.L-1 0.1 μμmol.L-1、1μmol·L-1、10 μmol·L-1、50 μmol·L-1 和 100 μmol·L1 的 DHEA 培养液孵育鸡胚原代肝细胞24 h。采用透射电镜观察线粒体形态和数量的变化、流式细胞术分析线粒体膜电位(△Ψm)变化;试剂盒检测琥珀酸脱氩酶(SDH)活性变化。结果表明,不同浓度DHEA处理对鸡胚原代肝细胞线粒体形态和数量并无显著性影响(P>0.05)。10μnol·L-1 DHEA处理可显著降低线粒体膜电位(P<0.05),而50 μmol·L-1和100 μmol·L-1 DHEA处理则极显著降低线粒体膜电位(P<0.01)。与对照组相比,1μmol·L-1 DHEA处理可显著增加琥珀酸脱氢酶的活性(P<0.05),10～100μmol·L-1 DHEA处理则极显著增加琥珀酸脱氢酶的活性(P<0.01)。以上结果提示,DHEA处理可通过增加线粒体膜的通透性、提高琥珀酸脱氩酶的活性,促进肝细胞自身氧化代谢水平,从而抑制鸡胚原代肝细胞脂肪的沉积。