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MTⅡ作为天然生物源小分子蛋白,具有可降解、免疫原性低,可结合重金属和清除自由基等特点,目前,国内外关于MTⅡ作为纳米靶向给药系统药物载体的文献还没有报道,由于其独特的空间结构和氨基酸残基组成使其具有能够成为优质纳米靶向给药系统的药物载体变为可能,因此,本课题旨在用MTⅡ作为纳米药物载体,包被两种有代表性的抗癌药物(脂溶性药物多西紫杉醇(DTX)和水溶性药物硫酸长春碱(VBL)),再通过与叶酸偶联,制备出具有抗癌作用的纳米靶向给药系统,从而为临床治疗癌症提供更多,更好的选择方案。本文首次提出了以兔肝金属硫蛋白Ⅱ型(MTⅡ)为纳米靶向给药系统的药物载体,并以此为基础展开了研究。研究结果如下:1.确立了去溶剂化学交联法制备MTⅡ-NPS,并利用Design Expert 7.0软件进行响应面中心点试验设计,以粒径和Zeta电位为指标,对MTⅡ-NPS制备方案进行优化,得到优化方案为:MTⅡ浓度为1mg/mL,乙醇溶剂比为3.36,交联比为0.2,反应时间8h,对此优化方案制备的MTⅡ-NPS进行表征:通过扫描电镜观察其形态为大小均匀的圆整的球体;MTⅡ-NPS的平均粒径为122.1nm,粒径分布狭窄;MTⅡ-NPS的平均Zeta电位为-26.62mV;加10%甘露醇的MTⅡ-NPS冻干粉再分散性良好;对优化方案制备的FA-MTⅡ-NPS进行表征:通过扫描电镜观察其形态为些许粘连圆整的球形;FA-MTⅡ-NPS的平均粒径为133.7nm,粒径分布狭细窄;FA-MTⅡ-NPS的平均Zeta电位-22.13mV;加15%甘露醇的FA-MTⅡ-NPS冻干粉再分散性良好;证明了叶酸活性酯可偶联MTⅡ-NP,并测得叶酸活性酯与MTⅡ-NPS偶联量为132.4nmol/g;通过荧光显微镜观察,表明FITC可与纳米粒子FA-MTⅡ-NPS进行结合。2.通过去溶剂化学交联的方法制备MTⅡ-DTX-NPS,并利用Design Expert 7.0软件进行析因试验设计,以粒径、Zeta电位、包封率和载药量为指标,对制备方案进行优化,得到优化方案为:A:MTⅡ的浓度为1mg/mL;B:DTX加入比为1.06;C:乙醇溶剂比为1;D:交联比为0.5;E:反应时间10.8 h;对优化方案制备的MTⅡ-DTX-NPS进行表征:通过扫描电镜观察其形态为大小均匀的圆整的球体;平均粒径为215.4nm,粒径分布狭窄;测得平均Zeta电位为-26.13 mV;平均包封率和载药量分别为53.1%和36.89%;对优化方案制备的FA-MTⅡ-DTX-NPS进行表征:通过扫描电镜观察其表面形态为些许粘连圆整的球形;平均粒径为224.5nm,粒径分布狭窄;平均Zeta电位-21.36mV;测得了叶酸活性酯和MTⅡ-DTX-NPS的偶联量为101.3nmol/g;FA-MTⅡ-DTX-NPS具有较好的缓释性质,在72h内药物累积释放率达73.70%。3.通过去溶剂化学交联的方法制备MTⅡ-VBL-NPS,并利用Design Expert 7.0软件进行析因试验设计,以粒径、Zeta电位、包封率和载药量为指标,对制备方案进行优化,并进行验证性试验,得到优化方案为:A:MTⅡ的浓度为1.27mg/mL;B:VBL加入比为1;C:乙醇溶剂比为1;D:交联比为0.5;E:反应时间8h,对优化方案制备的MTⅡ-VBL-NPS进行表征:通过扫描电镜观察其形态为大小均匀圆整的球体;平均粒径为237.2nm,粒径分布狭窄;平均Zeta电位为-23.89 mV;平均包封率和载药量分别为64.3%和41.25%;对优化方案制备的FA-MTⅡ-VBL-NPS进行表征:通过扫描电镜观察其表面形态为些许粘连的圆整的球形,;平均粒径为248.8nm,粒径分布狭窄;测得平均Zeta电位-20.47mV;测得了叶酸活性酯和MTⅡ-VBL-NPS的偶联量为104.2nmol/g;FA-MTⅡ-VBL-NPS具有较好的缓释性质,在72h内药物累积释放率达82.65%。4.进行了制备药物FA-MTⅡ-DTX-NPS、FA-MTⅡ-VBL-NPS体外抗肿瘤细胞的研究:(1)应用 MTT 法研究制备药物 FA-MT Ⅱ-DTX-NPS、FA-MT Ⅱ-VBL-NPS 对 PC-3细胞生长的影响,结果表明,FA-MTⅡ-DTX-NPS、FA-MTⅡ-VBL-NPS对PC-3的生殖增长有显著的抑制作用,并测得作用PC-3细胞72h的ⅡC50分别为10.23±0.31μg/mL、62.97±0.28μg/mL。(2)采用流式细胞仪AnnexinV-FITC/PⅡ法研究制备药物FA-MTⅡ-DTX-NPS、FA-MTⅡ-VBL-NPS作用72h对PC-3细胞的抑制作用,研究发现,此条件下测得的细胞大部分为晚期凋亡或坏死细胞,并且,在一定浓度范围,随着FA-MTⅡ-DTX-NPS、FA-MTⅡ-VBL-NPS浓度的提高PC-3细胞凋亡率逐渐升高,药物对正常PC-3细胞的抑制作用也逐渐增强。(3)利用激光共聚焦显微镜观察药物对PC-3细胞的靶向性,研究发现,制备药物FA-MTⅡ-DTX-NPS和FA-MTⅡ-VBL-NPS具有良好的靶向性,与它们的阳性对照相比,靶向性更明显。(4)采用倒置显微镜观察IC50值下的浓度(10.23 μg/mL)的FA-MTⅡ-DTX-NPS和(62.97μg/mL)的FA-MTⅡ-VBL-NPS处理PC-3细胞72h,对PC-3细胞形态的影响,研究发现,FA-MTⅡ-DTX-NPS和FA-MTⅡ-VBL-NPS对PC-3细胞的形态有显著的影响,因此,可推断FA-MTⅡ-DTX-NPS和FA-MTⅡ-VBL-NPS对PC-3细胞有很好的抑制作用。从本文的研究结果可以看出,MTⅡ作为纳米药物载体是可行的,并且,制备出的FA-MTⅡ-DTX-NPS和FA-MTⅡ-VBL-NPS具有较高质量评价和体外抗肿瘤细胞能力,相信,随着研究的深入,以MTⅡ为载体的纳米给药系统将具有更好的应用前景。