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许多叶绿体蛋白均是由核基因编码的,它们在细胞质中被翻译成成熟的功能性蛋白或蛋白质前体物,然后再被运输到叶绿体中发挥各自的功能。多数叶绿体蛋白质从细胞质运输到叶绿体中是由转运肽(transit peptide,TP)的介导来实现的。该转运肽一般位于被转运蛋白的N端。在氨基酸序列一级结构上TP可被分为三个结构域,它们分别是N-端结构域、中间结构域和C-端结构域。在不同物种的同一个结构域之间或者同一物种的不同结构域之间,其序列通常具有高度的可变性,缺少一致序列或共同序列基序。每一个基序在叶绿体蛋白运输的特定过程中都发挥着至关重要的作用。1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基(the small subunits of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,RbcS)的叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide,cTP)是研究较为广泛的植物叶绿体转运肽之一。目前,拟南芥RbcS的cTP的结构域和部分基序的功能相对比较清楚,但是在单子叶植物RbcS的cTP中,其结构域和不同基序是如何发挥功能的还不是很清楚,特别是单子叶和双子叶植物的cTP是否具有物种特异性等至今鲜有报道。本研究首先利用生物信息学预测转运肽的大小,并克隆玉米RbcS的cTP基因,再采用类似方法克隆出水稻和拟南芥中的同源基因;其次较为详细分析了玉米和拟南芥RbcS的cTP之间的结构域和基序的序列特征,同时验证了其功能。本研究旨在阐明单子叶和双子叶植物的RbcS cTP功能的特异性的序列基础。其主要研究结果如下:1.玉米RbcS cTP基因的克隆和序列特征分析从玉米RbcS基因的启动子区筛选出一个cTP序列,用ChloroP预测了该序列大小为47AA。通过构建利用GFP做报告基因的瞬时表达载体和一系列N-端或C-端氨基酸点突变和部分氨基酸缺失等突变体,采用PEG介导的原生质体瞬时转化法将载体导入原生质体中。研究结果表明,完整cTP可将GFP信号定位到玉米绿化苗和黄化苗叶绿体中,并且第一或第二个ATG突变并不影响其叶绿体定位功能,但其定位效率有所降低,但是第三个ATG突变则导致cTP的叶绿体定位功能明显丧失。同样,如果该cTP的C端缺失一个或多个氨基酸均可引起该cTP的叶绿体定位功能丧失。因此,相关研究结果表明玉米RbcS cTP在叶绿体中的定位不是光依赖型的,该cTP需要至少47AA才能行使叶绿体靶向的完整功能。2.玉米和拟南芥的RbcS cTP的叶绿体靶向功能差异为了比较RbcS cTP在单子叶和双子叶物种中的叶绿体靶向功能,我们先用玉米RbcS cTP的氨基酸序列在NCBI中进行同源比较,从而获得拟南芥和水稻相应的RbcS cTP序列。采用PEG介导的原生质体瞬时转化法研究其功能。亚细胞定位结果显示,玉米和水稻RbcS cTP可将GFP信号定位到玉米、水稻或小麦等单子叶的叶绿体中,但是不能将相应的GFP信号定位到拟南芥叶绿体中;相类似,拟南芥RbcS cTP只能介导GFP信号定位到拟南芥的叶绿体中,而不能将GFP信号定位到玉米或水稻叶绿体中。这一结果证明,RbcS cTP的叶绿体靶向功能在单子叶和双子叶植物中可能具有物种特异性。3.N-端结构域在RbcS cTP的叶绿体靶向中具有重要作用为了明确RbcS cTP的N-端结构域在单子叶和双子叶植物中叶绿体靶向功能中的作用,我们通过交换玉米和拟南芥的RbcS cTP的N-端结构域,从而形成一系列人工嵌合型cTP。AhTP:GFP(玉米RbcS cTP的N-端加上拟南芥RbcS cTP的中间部分和C-端)可将GFP信号定位到玉米的叶绿体中,但是不能定位到拟南芥叶绿体。不过,MhTP:GFP(拟南芥RbcS cTP的N-端加上玉米RbcS cTP的中间部分和C-端)可介导GFP信号同时定位到拟南芥和玉米的叶绿体中。把拟南芥RbcS cTP的N-端结构域插入到玉米RbcS cTP的N-端和中间结构域中间的嵌合型DNMATP,其GFP信号定位到拟南芥和玉米的叶绿体中。而把玉米RbcS cTP的N-端结构域插入到拟南芥RbcS cTP的N-端和中间结构域中间的嵌合型DNAMTP,其GFP信号定位到玉米的叶绿体中,却不能定位到拟南芥叶绿体中。综上所有结果,拟南芥RbcS cTP的N-端结构域是叶绿体靶向关键结构域,而玉米RbcS cTP在叶绿靶向中N-端结构域可能和其它两个结构域协同作用来行使功能。