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目的:宫颈癌是女性第四大恶性肿瘤,高危型人乳头瘤状病毒（HR-HPV）持续感染是宫颈癌及癌前病变最主要的病因,其中HPV16是最常见的致癌型别。研究表明TLR9存在于宫颈上皮细胞内体膜上,能够与HPV16 E6、E7基因的非甲基化Cp G基序特异性结合,参与与HPV感染关系密切的宫颈癌等肿瘤的发生发展。基于细胞研究发现HPV16 E6、E7癌蛋白能够抑制TLR9的转录过程,提示TLR9与高危型HPV16感染及其癌基因的表达密切相关,然而,在宫颈病变的发生发展中两者的关系如何目前尚不清楚。本研究选择从正常宫颈、宫颈癌前病变到宫颈癌妇女为研究对象,形成宫颈病变发生发展的人群自然梯度,基于明确TLR9和HPV16癌基因表达与宫颈病变关系的基础上,探讨TLR9与HPV16感染及其癌基因表达在宫颈病变发展过程中的相互关系,以期为宫颈癌病因研究提供科学依据,为HPV感染妇女有效阻止宫颈病变恶性进展策略和措施的制定开拓新思路。方法:从2017年4月到2018年8月在山西医科大学第二医院妇科门诊,按照严格的纳入和排除标准,收集经病理学确诊的正常宫颈（NC）妇女124名、宫颈上皮内瘤变（CIN）妇女168名、宫颈鳞癌（SCC）妇女49名为研究对象,采用统一的结构式问卷收集研究对象的一般人口学特征以及生活习惯、卫生习惯、月经婚育史等与宫颈病变可能相关的因素。同时,收集研究对象的宫颈脱落细胞,应用导流杂交技术检测HPV感染及分型;采集宫颈活检组织标本,采用实时荧光定量PCR法检测TLR9 mRNA的水平,采用Western-blotting法检测TLR9蛋白及HPV16 E2、E6、E7、L1、L2蛋白的水平。应用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 8.0.2软件进行资料的方差分析、χ2检验、Fisher精确检验、spearman秩相关、多元logistics回归等统计分析。检验水准为ɑ=0.05（双侧）。结果:1.一般人口学特征及宫颈病变相关因素分析:多元logistics分析结果显示,与NC组比较,年龄≤35岁（OR=4.073（1.329,12.483））和被动吸烟（OR=1.874（1.133,3.100））是CIN发生的危险因素。被动吸烟（OR=3.469（1.453,8.287））和离异、丧偶及分居（OR=4.698（1.316,16.776））则是SCC发生的危险因素。2.HR-HPV感染和HPV16癌蛋白表达与宫颈病变的关系:随着宫颈病变的进展,HR-HPV(χ2趋势=55.549,P<0.001)及HPV16(χ2趋势=80.718,P<0.001)的感染率均呈上升趋势。与NC组比较,HPV16 E2蛋白高表达可降低CIN(a OR=0.255（0.066,0.980）及SCC（a OR=0.026（0.004,0.187））的发生风险;E6、E7蛋白高表达则增加CIN（a OR=4.299（1.224,15.093）;a OR=6.634（1.853,23.746））及SCC（a OR=11.815（1.844,75.698）;a OR=6.538（1.394,30.664））的罹患风险;L1（a OR=0.076（0.016,0.368））、L2（a OR=0.061（0.011,0.344））蛋白高表达、E2/E6比值升高（a OR=0.016（0.001,0.251））均可降低SCC的发生风险。未观察到L1、L2蛋白高表达、E2/E6蛋白比值升高与CIN有类似关系。3.TLR9表达与宫颈病变的关系:TLR9 mRNA（F=15.943,P<0.001）及蛋白（F=22.808,P<0.001）表达量在不同宫颈病变组间差异均有统计学意义,TLR9蛋白的表达量在SCC组明显高于NC组,而TLR9 mRNA的表达量则低于NC组（P<0.05）。随着宫颈病变程度的加重,TLR9蛋白的表达逐渐升高(χ2趋势=9.661,P=0.002),TLR9蛋白高表达可增加SCC的发生风险（OR=3.912（1.341,11.409））。未观察到TLR9 mRNA与宫颈病变之间有类似关系。4.TLR9与HPV16感染及癌基因表达的关系:在HPV16阳性妇女中,TLR9mRNA的表达量低于HPV16阴性妇女,而TLR9蛋白的表达量则高于HPV16阴性妇女（P<0.05）,在HR-HPV阳性妇女中也观察到类似关系。采用spearman秩相关分析显示,TLR9蛋白与HPV16 E2、E6、L1、L2蛋白的表达均呈正相关（rs=0.250,P=0.004;rs=0.174,P=0.05;rs=0.257,P=0.003;rs=0.253,P=0.004）,而TLR9 mRNA与HPV16癌蛋白的表达之间均未显示统计学相关。5.宫颈病变进展中TLR9与HPV16感染及癌基因表达的关系:在NC和CIN组中,HPV16阳性妇女TLR9蛋白的表达量高于HPV16阴性妇女,在SCC组中HPV16阳性妇女TLR9蛋白的表达量则低于HPV16阴性妇女（P<0.05）。在CIN组中观察到HPV16阳性妇女TLR9 mRNA的表达量低于HPV16阴性妇女（P=0.001）,但在NC和SCC组中未见类似关系。采用spearman秩相关分析显示,在CIN妇女中,TLR9蛋白分别与HPV16 E2、E6、E7、L1、L2蛋白的表达呈正相关（rs=0.241,P=0.04;rs=0.231,P=0.05;rs=0.271,P=0.02;rs=0.280,P=0.016;rs=0.368,P=0.001）,在SCC组中也有类似关联。但在NC、CIN和SCC组中均未观察到TLR9 mRNA与HPV16癌蛋白的表达之间存在统计学相关。结论:1.年龄小于35岁的妇女发生宫颈上皮内瘤变的风险增高,离异、丧偶及分居的妇女发生宫颈癌的风险较大,被动吸烟可增加宫颈癌及其癌前病变的发生风险。2.HR-HPV、HPV16感染可增加宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的发生风险。特别是从癌基因的角度发现,HPV16 E6、E7癌蛋白的高表达可显著增加宫颈癌及其癌前病变的罹患风险,再次证实了HPV16致癌基因在宫颈癌变中的重要作用。本次随着宫颈病变恶性程度的进展,E2/E6蛋白比值、L1、L2蛋白降低的结果,验证了E2/E6蛋白比值和L1、L2蛋白对HPV与宿主DNA整合的标志性作用。3.TLR9蛋白高表达可增加宫颈病变的发生风险,TLR9蛋白升高可能是宫颈病变进展的预警标志。特别发现在HPV16阳性的癌前病变妇女中,TLR9蛋白的表达明显高于HPV16阴性妇女,且与HPV16癌蛋白的表达呈正相关关系。提示TLR9蛋白的高表达与HPV16感染及其癌蛋白的升高有关,在妇女中大力推广TLR9的检测,为临床上TLR9干预剂的应用提供一定的依据。