前列腺癌是目前西方国家男性中仅次于肺癌的主要癌症,尽管前列腺癌发病率在发展中国家为5.3%,远低于发达国家的19%,但近年来随着人口的老龄化和生活条件的改善,以及医学检查手段的革新,曾经前列腺癌发病率远低于世界水平的中国,现发病率正逐年上升。前列腺癌在我国男性泌尿、生殖系统肿瘤中排名逐渐靠前,正一步步影响着老龄男性的生活质量和预期寿命。由于前列腺特异性抗原(PSA)的引入,前列腺癌的(早期)检出率和发病率确有提高。在西方国家广泛展开了PSA筛查后,效果卓著,前列腺癌的死亡率下降了45%。然而,因为血清PSA与前列腺增生、前列腺炎和癌症都是密切相关的,故而PSA筛查仍存在一定缺陷,主要是在于它的肿瘤非特异性,以及由此导致的过度穿刺及过度治疗。因此,除了PSA检测,仍有必要采用其他方法进行前列腺癌早筛早诊。虽然目前已有一些潜在的标记物被报道和应用,但继续寻找具有比PSA更好的前列腺癌生物标志物仍具有较为重大的意义。近年来,一些研究已经证明癌症患者产生抗肿瘤相关抗原的血清抗体,表明这种自身抗体是潜在的非侵入性诊断和预后生物标志物。例如,p53、细胞周期蛋白和各种核蛋白的自身抗体据研究可作为癌症早诊指标。前列腺癌患者中,产生抗α-甲基酰辅酶A消旋酶(AMACR)的抗体,并由于前列腺癌上皮细胞的基因扩增而被上调。此外,针对外源抗原上升的血清抗体也具备成为诊断指标的潜力。前列腺易被人乳头状瘤病毒(HPV)、多瘤病毒等病毒感染。HPV已明确作为宫颈癌的高危因素,且该病毒易通过性传播方式造成相互感染,前列腺也应同样面临感染的风险。近些年研究表明,高危型HPV感染与前列腺癌存在一定关联,HPV易引起慢性前列腺炎,从而促进前列腺癌的发生。探究HPV感染使机体产生的抗体能否作为前列腺癌的潜在诊断指标,是本研究的目标之一。我们采用了极其适合研究血清抗体的多肽微阵列平台开展了相关工作。本学位论文由以下两部分组成:第一部分前列腺癌患者血清中HPV-16蛋白抗体谱绘制目的:绘制前列腺癌患者血清中HPV-16蛋白的抗体谱。方法:我们将HPV-16的7个功能蛋白(HPV-L1,HPV-L2,HPV-E1,HPV-E2,HPV-E4,HPV-E6和HPV-E7)叠瓦式切割为多肽序列(以20aa的长度及10aa的重复度)并化学合成得到233条多肽,将合成好的多肽固定于i PDMS膜上制备成多肽微阵列。用包含有这些HPV多肽的多肽微阵列对收集的212份临床病理确诊为前列腺癌的患者血清样本及229份健康人血清样本进行血清学筛选。通过血清学筛选结果绘制前列腺癌患者血清中HPV-16蛋白的抗体谱。结果:HPV-16蛋白的233条多肽对前列腺癌血清与健康人血清均能产生响应,且对前列腺癌血清的响应显著更强,说明这些前列腺癌血清中存在针对这些多肽的更特异性的抗体。从前列腺癌血清对这7种功能蛋白各自的响应分布来看,前列腺癌血清和健康人血清对HPV-E5蛋白的多肽均无强响应;在其他蛋白中,多条多肽对前列腺癌血清的响应覆盖率在10%以上,而极少数多肽对健康人血清的响应覆盖率也超过了10%,如HPV-206,说明健康人血清也可能对HPV-16的多肽产生强响应。结论:前列腺癌与健康人血清中对HPV-16多肽的响应可能是抗体对表位多肽的特异性响应,也可能是分子模拟、模拟表位及血清中抗体与多肽的交叉响应导致的。所以健康人血清亦可对HPV-16的多肽产生响应,且对部分多肽产生强响应。同时,相对于健康人血清来说,前列腺癌血清对HPV-16的多肽有更强的相关性与特异性,故其对这233条HPV多肽的响应显著强于健康人血清对多肽的响应。前列腺癌血清中存在针对HPV-16的7个功能蛋白的特异性抗体,说明HPV-16感染与前列腺癌相关,其相关性可通过血清学进行抗体检测。第二部分HPV-16蛋白多肽在前列腺癌诊断中的应用目的:筛选HPV-16的7个功能蛋白中前列腺癌特异性的抗原表位序列,探讨HPV-16的抗原表位在前列腺癌辅助诊断中的应用。方法:首先用IEDB对HPV-16的7个功能蛋白进行抗原表位的预测。在对212份前列腺癌血清与229份健康人血清进行HPV多肽的血清学筛选后,用SAM分析法获得在前列腺癌中有统计学差异的高响应多肽,并通过序列分析获得其抗原表位序列。通过组合分析筛选得到可用于前列腺癌诊断的多肽组合,并用ROC曲线分析获得该多肽组合对前列腺癌进行诊断时的最佳阳性判断阈值,使得该多肽组合对前列腺癌进行诊断时可获得最优的敏感度与特异性。结果:经IEDB分析,除HPV-E5外的六个蛋白预测得到多个可能的抗原表位序列,HPV-E5上几乎未预测得到抗原表位序列。SAM分析得到57条在前列腺癌血清中显著高表达的多肽,从这57条多肽中通过序列分析找到了蛋白上的表位序列。序列分析发现HPV-L1蛋白中有11条包含有表位的序列,HPV-L2蛋白中有7条包含有表位的序列,HPV-E1蛋白中有10条包含有表位的序列,HPV-E2蛋白中有6条包含有表位的序列,HPV-E4、HPV-E6与HPV-E7蛋白中均有2条包含有表位的序列,HPV-E5蛋白中没有包含有抗原表位的序列。将这些实验得到的表位序列与预测表位序列相比对,发现预测表位序列与实验所得表位序列虽有一定差异(如几个蛋白均出现了鉴定出的表位序列不精确而与预测表位序列有一定差异,及多个预测表位在实验中未能鉴定出来的现象),但大致相符。组合分析得到了13条可用于前列腺癌诊断的多肽组合,ROC分析发现将血清对该多肽组合的响应count数最佳阈值为2,即当血清对这13条多肽中任意两条多肽的响应为阳性时,则判断该血清为前列腺癌血清。在count≥2的阳性判断阈值下,这13条多肽对前列腺癌的诊断可达到最优的敏感度(80.2%)与特异性(88.2%)组合。结论:实验得到的HPV-16的7个功能蛋白的抗原表位序列与IEDB预测得到的序列大致符合,说明这些相符的表位序列可能是真实存在的,也说明了实验结果的正确性与可信性。前列腺癌患者血清中存在的针对除HPV-E5蛋白以外的HPV-16的6个功能蛋白的特异性抗体可通过HPV-16的多肽微阵列加以检测。血液中特异性抗体可作为一种非常有前景的肿瘤辅助诊断生物标志物,本研究结果也展示了HPV-16蛋白多肽具有潜在的前列腺癌临床辅助诊断研究前景和价值,其进一步的临床应用推广有待进一步探索。