【摘 要】
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目的:为了模拟组织细胞外基质（ECM）的组成成分,采用冷冻干燥法,以丝素蛋白（SF）、纳米羟基磷灰石（nHAp）和透明质酸（HA）为原材料,并加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为交联剂,制备了SF/nHAp/HA多孔复合支架材料。对其理化性能、体外细胞生物相容性以及对骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的影响进行研究,从而为临床中修复骨缺
【基金项目】
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山西应用基础研究项目“用于引导性骨再生技术的具有不同二级结构的丝素/氧化石墨烯复合膜的研究”（编号:201701D221065）； 山西医科大学博士启动基金项目“用于种植位点骨缺损修复的丝素/羟基磷灰石/氧化石墨烯多孔支架的研究”（编号:BS03201638）； 山西重点研发计划项目“用于骨修复的丝素/羟基磷灰石/氧化石墨
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目的:为了模拟组织细胞外基质（ECM）的组成成分,采用冷冻干燥法,以丝素蛋白（SF）、纳米羟基磷灰石（nHAp）和透明质酸（HA）为原材料,并加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为交联剂,制备了SF/nHAp/HA多孔复合支架材料。对其理化性能、体外细胞生物相容性以及对骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的影响进行研究,从而为临床中修复骨缺损相关材料提供新思路。方法:1.采用共混、交联、冷冻干燥等方法制备了不同透明质酸（HA）比例的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石/透明质酸（SF/nHAp/HA）多孔复合支架材料。分别得到五组样品材料:SF/nHAp、SF/nHAp/1.5wt%HA、SF/nHAp/2.5wt%HA、SF/nHAp/5.0wt%HA和SF/nHAp/7.5wt%HA。采用扫描电镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）、X射线光电子能谱（XPS）、万能材料试验机和降解实验等分析技术,对支架的形貌、二级结构、孔径、孔隙率、吸水能力、力学及降解性能进行测量和分析,探讨HA对多孔支架性能的影响。2.大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）原代培养并做流式鉴定后,将BMSCs接种于各组支架材料上,评价材料的体外细胞相容性。培养7 d后,利用SEM观察细胞的分布情况及形态。培养1、3和7 d后,采用CCK-8法检测细胞增殖情况。活/死细胞染色（living/dead staining）后,使用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察细胞活力。3.为了评价材料的体外成骨分化能力,将BMSCs接种于各组材料上成骨诱导4、7和14 d后,用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒进行定量测定。成骨诱导7、14和21 d后,进行茜素红染液染色及钙(Ca2+)沉积的半定量分析。结果:1.通过SEM观察显示所有多孔支架均具有典型的三维多孔结构,孔隙连续且相互连通。这就说明复合支架中SF、nHAp和HA之间具有良好的相容性且没有明显的团聚和析出现象。SF/nHAp多孔支架中引入HA之后,由于HA的粘度较高,抑制冰核的生长,所以SF/nHAp/HA多孔支架的平均孔径逐渐减小（SF/nHAp组109.6±0.57μm,SF/nHAp/1.5wt%HA组108.8±0.51μm,SF/nHAp/2.5wt%HA组107.1±0.37μm,SF/nHAp/5.0wt%HA组106.3±0.46μm,SF/nHAp/7.5wt%HA组103.0±0.51μm）。相反,多孔支架的孔隙率有所增加（87.5～94.2%）。XRD、FT-IR和XPS结果显示,所有多孔支架都主要由Silk I和少量Silk II结构组成,且复合支架中的HA得到了有效交联。水溶性和力学性能测试结果表明,当HA含量为7.5wt%时,由于Silk I含量不足以包覆高含量HA,使得SF/nHAp/HA多孔支架在水中趋于不稳定。然而当HA的加入量小于5.0wt%,尤其是比例为5.0wt%的SF/nHAp/HA支架具有最高的吸水性和力学性能。降解实验结果表明,HA的加入降低了复合支架的降解速率。2.根据SEM、LSCM及CCK-8等体外细胞实验结果表明,在7d的细胞培养过程中,五组支架材料的细胞数量都呈现出增加趋势,均显示出良好的细胞相容性。然而,BMSCs在SF/nHAp/5.0wt%HA多孔支架上增殖最快,说明适量的HA可以支持细胞的黏附和增殖。3.体外成骨诱导分化实验结果显示,ALP的活性随时间的延长而逐渐增加,且在每个时间点SF/nHAp/5.0wt%HA多孔支架上细胞的ALP活性表达和钙盐沉积量均高于SF/nHAp、SF/nHAp/1.5wt%HA、SF/nHAp/2.5wt%H和SF/nHAp/7.5wt%HA组多孔支架,显示出良好的细胞成骨诱导能力。结论:本研究采用冷冻干燥与化学接枝法合成一种SF/nHAp/HA多孔支架材料,通过控制HA的含量,能有效地调节支架的整体理化性能。通过细胞粘附、活力和增殖实验反映了SF/nHAp/5.0wt%HA相比其他四组材料具有良好的体外细胞相容性;另外,体外成骨诱导分化实验也反映了SF/nHAp/5.0wt%HA具有更好的体外成骨能力。总之,HA提高了复合材料的体外细胞相容性和生物活性,有望为骨组织的修复重建提供了一种新的材料。
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