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背景:肝移植术后胆道并发症发生率高,是影响患者长期存活及导致移植物丢失的最主要原因之一,因此肝移植后胆道并发症的防治是进一步提高移植受体存活率和远期疗效的关键。移植肝胆管缺血再灌注损伤是肝移植术后胆道并发症的重要病因学因素,肝脏缺血再灌注损伤是早期多种炎性因子激活的结果。NF-κB作为一种普遍存在的转录因子在调节炎症反应的基因中起关键作用。研究肝胆管缺血再灌注损伤过程中NF-κB的作用,并以其为靶点的干预措施有可能对移植肝胆管缺血再灌注损伤具有保护作用。本研究拟观察腺相关病毒携带NF-κB超抑制物IκBαM（ rAAV- IκBαM）对肝移植胆道缺血再灌注损伤的保护作用。第一部分大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型的建立及肝脏再灌注损伤中NF-κB激活的研究目的建立稳定的大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型,观察建立模型手术并发症、存活率及肝脏缺血再灌注损伤中NF-κB的激活。方法门静脉和腹主动脉双重灌注法建立大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型,将Weistar大鼠随机分成两组:肝移植胆道缺血再灌注损伤手术组（liver transplantation-IRI group,LT-IRI group）:行大鼠原位肝移植胆道缺血再灌注损伤;假手术组（Sham group, SH group）:仅行开腹和肝门区解剖手术;分别于术后12h, 24h,72h,7d取肝组织行NF-κB免疫组化检测,取外周血检测肝脏酶学指标。结果共进行大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型80例,其中稳定模型60例,稳定模型期手术存活率约90%,一周存活率约为81.7%。免疫组化显示术后2hLT-IRI组NF-κB激活细胞明显多于SH组（p<0.01 ）;而其肝功能损伤指标（外周血ALT）在各时点LT-IRI组均较SH组亦明显增加,两组比较具有明显差异,以术后24h最为显著（417.2±45.3 vs 57.6±5.4, p<0.01）。结论成功建立大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型,无肝期约14±3 min。肝移植缺血再灌注过程中早期即有NF-κB的激活。第二部分IκBαM基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定目的构建携带NF-κB超抑制物IκBαM基因的重组腺病毒载体。方法应用BamHI和XholI内切酶双酶切pAAV-MCS质粒和PcDNA3.0-IκBαM,经过胶回收和纯化后,在T4连接酶作用下,构建pAAV-MCS-IκBαM,酶切和测序鉴定,293细胞病毒包装,重组腺病毒载体大量扩增,病毒滴度的测定及浓缩纯化。结果经双酶切和连接成重组质粒pAAV-MCS-IκBαM,双酶切pAAV-MCS-IκBαM得到大小分别为6.4Kb和970bp的载体和目的基因片段;经PCR鉴定得到大小为970bp的IκBαM片段;测序鉴定正确;经测定分离浓缩和纯化重组腺相关病毒获得病毒滴度约为7×108pfu/ml～5×109pfu/ml。结论成功构建IκBαM基因重组腺相关病毒载体,病毒浓缩纯化滴度满足实验要求。第三部分rAAV-IκBαM对大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤的保护作用目的观察rAAV-IκBαM转染肝脏术后肝内NF-κB及其下游炎性分子的表达,胆管内皮细胞的凋亡和电镜形态学变化情况,探讨rAAV-IκBαM在大鼠肝移植胆道缺血再灌注损伤中的作用。方法将Weistar大鼠分为三组:假手术组（单纯行开关腹手术）,对照组（行肝移植胆道缺血再灌注损伤手术）, rAAV- IκBαM转染组（术前两天行rAAV-IκBαM转染）。分别于术后2h, 24h, 72h, 7d取材。常规HE染色观察肝外胆管和肝组织学变化,用western blot检测NF-κB p65的表达, RT-PCR测定肝组织中TNF-α、ICAM-1 mRNA的表达,免疫组化检测TNF-α、ICAM-1的表达,ELESA检测血清TNF-α的水平,各时点肝脏酶学的变化及胆管内皮细胞的凋亡和电镜形态学变化。结果rAAV- IκBαM转染组与对照组相比:NF-κB p65于术后2h、24h表达具有显著性差异,核内蛋白水平明显降低,72h后各时点NF-κB p65核内蛋白差异不明显;术后2h、24h TNF-α及ICAM-1 mRNA的表达水平具有显著性差异;免疫组化示TNF-α、ICAM-1于移植后24h、72h的表达具有显著性差异;术后24h血清TNF-α具有显著性差异;肝脏酶学指标（ALT、GGT）在各时点具有显著性差异,尤其在术后24h, 72h最为显著;术后2h、24h、72h胆管内皮细胞的凋亡明显减少;术后24h电镜下胆管内皮细胞的损伤明显减轻。各移植组与假手术组差异显著。结论IκBαM通过抑制NF-κB核移位抑制其激活及抑制其下游基因的表达,从而减轻大鼠肝移植胆管缺血再灌注损伤。