本论文旨在研究不同的宰前应激因素对猪肉质、福利以及血液生理生化指标的影响,并在细胞水平上探讨应激对肉质影响的分子机制。首先选择120头氟烷基因型为NN的二元杂交猪商品猪(长白猪×大白猪),通过不同的宰前禁食时间(禁食8 h组、禁食24 h组)、运输压力(3种不同的运输密度：低密度230 kg/m2、中等密度275 kg/m2、高密度325 kg/m2；3种不同的运输时间：短时间45 min、中等时间3h、长时间5 h)、宰前休息方式(休息3 h+玩具组、休息3 h组、不休息组)以及宰杀方式(直接刺杀心脏放血、电麻击晕后放血)等处理后,研究宰前应激因素对猪宰前的行为、宰后的肉质以及血液中的生理生化指标的影响。提出了猪遭受应激后血液中皮质醇与ACTH浓度升高是屠宰后肉质下降的主要因素。据此,根据宰前应激的大小,将运输压力处理组72头、宰前休息组中且没有经历任何休息的8头以及屠宰方式中的16头归类成应激程度较大组即应激组；将宰前休息组中运输45 min后休息3 h的16头猪归类成应激程度较轻组即对照组。相关性分析表明随着皮质醇升高,肉质相应发生显著的变化。其次利用鼠源肌细胞以及猪原代肌细胞,在细胞培养基中添加一定量的地塞米松(DEX,一种人工合成的糖皮质激素,猪中皮质醇属于糖皮质激素的一种)建立肌细胞应激模型。在细胞水平上揭示了DEX通过影响钙离子通道来决定肌细胞是否存活或者走向凋亡,进而影响宰后的肉质。主要研究结果如下：结果表明：①禁食24 h组与禁食8 h组相比,猪血浆中皮质醇、促肾上腺皮质激素(ACTH)浓度、乳酸含量、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性以及血糖浓度差异不显著(P>0.05),但皮质醇、ACTH浓度平均值较低。②禁食24 h组中半膜肌45 min的导电率(EC45min)与24 h pH值(pH24)显著高于禁食8 h组(P<0.05),其它肉质指标没有显著变化。③禁食24 h组中淋巴细胞绝对值(W-SCC)、红细胞体积分布宽度-SD (RDW-SD)显著高于禁食8 h组(P<0.05),其它的血液成分指标没有显著性变化(P>0.05)。不同的禁食时间对猪应激有一定的影响,对部分肉质、免疫指标有显著影响。综合考虑猪福利、肉质、免疫指标、经济以及屠宰后猪肠道内容物对猪胴体的影响,我们应该优先考虑禁食24 h。试验采用3×3双因素设计,将3种不同的运输密度和3种不同的运输时间两两组合成9种不同的运输压力组,每组8头猪共72头,各组运抵屠宰场后立即屠宰。结果表明：①运输5 h组中皮质醇、ACTH含量、LDH活性显著高于运输45 min组(P<0.05),运输3 h组的乳酸含量显著低于运输45 min与5 h组,血糖浓度随着运输时间的延长显著性降低(P<0.05)；高密度组中ACTH浓度、LDH与CK酶活性显著高于中等密度与低密度组(P<0.05),皮质醇浓度显著高于中等密度组(P<0.05),低密度组中乳酸水平显著低于中等密度与高密度组(P<0.05)。②运输45 min组中背最长肌EC45min显著高于运输3 h与5 h组(P<0.05),运输5 h组中背最长肌24 h色值(MC24)显著高于运输3 h与45 min组(P<0.05),运输3 h组中半膜肌MC24显著高于3 h与5 h组(P<0.05),运输3 h的背最长肌pH45min与pH24值显著低于运输5 h组(P<0.05)；高密度组中半膜肌45 min色值(MC45min)和MC24显著高于低密度组(P<0.05),pH45min与pH24则显著升高(P<0.05)；高密度组中半膜肌MC45min显著高于中等密度组(P<0.05)；中等密度组半膜肌pH24显著高于低密度组(P<0.05)。③运输3 h组中红细胞数目(RBC)、血红蛋白含量(HGB)与胞压积(HCT)显著低于运输45 min与5 h组(P<0.05)；运输5 h组的中平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)显著低于运输45 min与3 h组(P<0.05)。高密度与长时间运输都存在不利影响,在实际的运输过程当中,运输时间不易过长也不易过短,2-3 h的运输时间对猪比较适合；密度越低越好,但试验结果显示中等密度与低密度运输比较,其影响远没有高密度大。综合考虑运输成本,建议在运输的过程中选择的275kg.m-2运输密度。试验共分为三个处理组：休息3 h+玩具组、休息3 h组、不休息组,每组20头猪共60头,其中两种不同方式的3 h休息组中各20头休息时进行精神评分,随后各组随机选择8头用于后续血液指标以及肉质分析。结果表明：①3 h休息+玩具组中3个时间段的精神评分显著高于3 h休息组,随着时间的延长猪趋于平静。②3h+玩具组、休息组中皮质醇、ACTH浓度显著低于不休息组(P<0.05),相反LDH、CK酶活性显著高于不休息组(P<0.05),而3 h+玩具组与3 h休息组差别不显著(P>0.05)。③3个休息处理组中肉质指标没有显著差别(P>0.05)。④3 h休息+玩具组、3 h休息组中RBC、HGB)、HCT与W-SCC显著低于不休息组(P<0.05);3 h休息+玩具组中白细胞数(WBC)显著高于不休息组；3 h休息组中W-SCC显著低于不休息组；而3 h休息+玩具组与3 h休息组中所有的免疫指标没有显著差异(P>0.05)。上述的试验结果提示：宰前一定要让猪有一个休息的过程。这种措施能有效缓解猪的应激；在休息的过程中,添加部分福利玩具,对猪的精神状态有明显的好处。因此,在实际操作过程中,应该让猪有一个休息的过程；并建议在休息栏中添加一些福利玩具如篮球、废旧轮胎等以满足猪的福利需求。试验选择两个处理组：直接刺杀心脏放血组与电麻击晕(75 V,1.5 A,3-4 s)后放血组,每组8头猪共16头,各组运抵屠宰场后立即屠宰。结果表明：①与直接刺杀心脏放血组相比,电麻击晕组中猪血浆皮质醇、ACTH浓度与乳酸含量显著降低(P<0.05),LDH、CK酶活性以及血糖浓度差异不显著(P>0.05)。②不同的宰杀方式对肉质没有显著影响(P>0.05)。③与直接刺杀心脏放血组相比,电麻击晕组中只有平均红细胞血红蛋白含量(MCH)显著降低(P<0.05),而其它的血液指标没有显著性变化(P>0.05)。上述的试验结果提示：屠宰方式对肉质与免疫力的影响较小,但对反映应激程度的激素指标如皮质醇、ACTH浓度差异显著。在屠宰过程中,经历电麻击晕方式的猪比直接刺杀心脏放血屠宰应激程度要小很多。从动物福利角度考虑,电麻击晕优于直接刺杀心脏放血。因此,在这两种屠宰方式选择上,应该优先考虑电麻击晕这一屠宰方式。①应激组中猪血浆中的皮质醇浓度极显著升高(P<0.01),较对照组上升了约40%;ACTH浓度较对照组相比达到显著性水平(P<0.05),上升约15%。②背最长肌中应激组pH24与对照组相比,极显著上升(P<0.01)；半膜肌中,应激组EC45min、EC24、pH45min、pH24和MC45min等肉质指标与对照组相比达到差异极显著(P<0.01)或者显著性水平(P<0.05)。此外,尽管在背最长肌中只有pH24发生显著性变化,而其它肉质指标在背最长肌与半膜肌中出现相同的变化趋势即在应激组中较对照组EC45min、EC24、pH45min、pH24出现上升趋势,MC45min与MC24出现下降趋势。③皮质醇与ACTH浓度显著正相关(r2=0.225,P<0.05)；背最长肌中pH24与血浆中皮质醇浓度显著性正相关(r2=0.265,P<0.05),而与ACTH浓度呈显著负相关(r2=-0.2195,P<0.05);半膜肌中EC45min、EC24、pH45min、pH24与皮质醇浓度显著性正相关(P<0.05)；同时MC24也与ACTH浓度呈显著性正相关(P<0.05)；而EC45min与ACTH浓度显著性负相关(P<0.05)。对比应激激素在背最长肌与半膜肌中的肉质指标相关性发现：两种肌肉组织中,相关性的正负趋势基本一致。④细胞应激模型表明：DEX对肌细胞有明显的细胞毒性,导致细胞内酶LDH大量逃逸到胞外。诱使核小体崩解,形成明显的DNA ladder,同时细胞的形态亦发生明显的变化,细胞膜变形损坏,细胞核固缩受损。另外,DEX迫使胞质中的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)大量上升,造成细胞自由氧化基应激。流式细胞分析进一步表明,DEX能够使细胞凋亡数量和损伤数量增大。BAX基因表达量随DEX刺激浓度的增加而上调,Bcl-2与之相反。Cytochrome C在DEX刺激下出现升高趋势,另一凋亡执行蛋白Caspase-3的表达量上升。这四个凋亡相关基因在基因水平和蛋白水平上都表现出相似的变化趋势。且均具有浓度依赖效应。等浓度的RU486(mifepristone,米非司酮,糖皮质激素受体阻断剂)能够完全抑制DEX的生物学效应。以上试验结果提示宰前应激产生的激素皮质醇迅速穿过肌细胞膜后,扰乱了细胞的正常生理活动,使细胞出现氧化应激,细胞随即启动凋亡程序,相关凋亡基因被激活,细胞表现出明显的凋亡现象。非正常的肌细胞最终会影响宰后的肉质。在猪的11个组织中,糖皮质激素受体a (glucocorticoid receptor a, GRa)以及钙离子通道相关蛋白IP3R1(执行将钙离子从肌浆网中泵入到胞质中)与SERCA1(执行将钙离子从胞质中泵入到肌浆网中)在背最长肌中高表达,提示这三个基因在肌肉组织中可能发挥很重要的作用。在C2C12细胞以及猪原代肌细胞中,DEX在基因以及蛋白水平都下调GRα的表达,但能提高GRα移位到核内的能力。DEX孵育后,两种不同的钙离子通道发生相反的变化,IP3R1随着DEX浓度加大表达量上升,而SERCA1却呈现出相反的趋势。由于肌细胞将泵入钙离子到肌浆网中的能力不足,DEX导致胞质中的钙离子出现超载现象。钙离子的紊乱引发下游的依赖性钙离子相关蛋白酶的激活,同时钙离子也激活了细胞凋亡程序,迫使细胞由正常走向凋亡。DEX诱发细胞走向凋亡的生物学功能能够完全被RU486阻断。许多研究表明,DEX的调控作用是通过核调控因子GRα介导。而GRa的很多核调控功能是通过其本身结合到靶基因转录调控区域的GRE上实现的。通过基因组步移分别得到IP3R1以及SERCA1转录起始位点上游2641 bp以及2540 bp片断。生物信息学分析表明：IP3R1的转录起始位点之前327 bp处有一得分较高的GRE元件,而SERCA1的转录起始位点之前不存在得分较高的GRE元件。将这两个基因转录起始位点之前约1500 bp用于构建pGL3的缺失片断报告基因质粒。IP3R1中缺失GRE元件的质粒(pGL3-IP3R1-300)启动子活性急剧下降,同时随着DEX浓度的提高质粒pGL3-IP3R1-480活性较pGL3-IP3R1-300活性升高。专门表达GRE元件质粒pGL-GRE以及RU486能够消减pGL3-IP3R1-480质粒的活性。EMSA试验证实,DEX通过GRa诱导IP3R1表达是依赖IP3R1启动子区域的GRE元件实现。以上的结果提示：应激导致皮质醇升高,皮质醇通过细胞膜后将活化的GRa移位进入核中,与IP3R1基因调控区域的GRE结合上调IP3R1的表达,使钙离子从肌浆网大量流失到胞质中,钙离子浓度的紊乱启动了细胞凋亡程序,受损的肌细胞导致了肉质的变化。结论：①综合考虑猪的福利、应激程度以及宰后肉质的变化等,建议在生产过程中选择24 h的禁食时间,运输密度控制在275 kg/m2以内,运输时间在3 h左右,宰前有一个3 h的休息时间并给予猪能够拱咬的福利玩具,屠宰时选择电麻击晕(75 V,1.5 A,3-4 s)后放血致死的宰杀方式。②皮质醇引起的肌细胞凋亡是通过皮质醇结合到GRα的激素结合区活化胞质中GRα并移位进入细胞核,与钙离子释放通道基因IP3R1调控区域的GRE元件结合后上调IP3R1基因表达,导致胞质中钙离子超载引发钙离子诱导细胞凋亡的信号途径,进一步影响宰后的肉质。