第一部分ITP中自身免疫性初始B细胞的积累研究背景:自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AIDs)是由于机体不能维持对于自身分子的免疫耐受而引起的一系列疾病的统称。原发性免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)作为临床上最常见的自身免疫性出血性疾病,流行病学调研显示其发病约占临床总出血性疾病事件的1/3,ITP以抗血小板自身抗体产生过多,血小板计数减少和随之产生的出血风险升高为主要特征。临床表现为皮肤粘膜出血,重症患者可因内脏出血或者颅内出血而致死亡。ITP的发病机制尚未完全阐明,目前学术界的主流观点认为其与机体对于自身抗原(主要是血小板膜表面糖蛋白,包括GP Ⅱb/Ⅲa,GP Ib/IX和GP Ⅰa/Ⅱa等)的免疫失耐受密切相关。据统计在大约37-67%的ITP患者中出现抗血小板自身抗体的血清学检测阳性,这些自身抗体介导了网状内皮系统对于血小板的过度清除,致使外周血小板消耗加速;而骨髓中的巨核细胞成熟障碍和凋亡异常则导致了血小板产生和释放减少。除了与抗体产生相关的体液免疫异常之外,细胞免疫功能紊乱也被认为在ITP的病理生理机制中发挥了重要作用,例如细胞毒性T淋巴细胞介导的对于血小板的直接破坏,辅助性T细胞(helperT cell,Th)比例失调(Th1/Th2比值升高),调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)功能缺陷等也促进了 ITP的发生发展。抗血小板自身抗体目前被公认为是导致ITP的关键致病因子,其来源对于探明ITP的发病机制具有重要意义,但是目前导致自身抗体产生的潜在机制尚不清楚。B淋巴细胞通过分泌抵抗抗原的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)在维持人体免疫稳态方面起着至关重要的作用。在B细胞发育进程中,Ig通过骨髓中的V(D)J重组、外周抗原驱动的体细胞高频突变和同种型转换等多种机制,极大地丰富了其多样性。然而随着Ig库被广泛多样化,形成了包括自身反应性在内的不可预测的特异性。在这些过程中,可能会产生针对于自身抗原的抗体作为副产品。自身反应性抗体通常可以经骨髓和外周的免疫耐受机制被有效清除。骨髓中的早期B细胞具有高度的自身反应性,但其大部分可由中枢免疫耐受检查点清除,仅对外周成熟的初始B(Naive B)细胞库贡献了一小部分。一些自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus,SLE)和类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA),在B细胞发育早期未能建立自身免疫耐受。早期自身免疫耐受受损导致外周血初始B细胞积累,外周初始B细胞随后被筛选并进化成与疾病相关的抗体分泌B细胞。在ITP患者中,抗血小板抗体通常是同种型转换的IgG并且是体细胞突变的,表明生发中心的晚期B细胞耐受性是有缺陷的。但是,目前人们对于ITP中早期B细胞免疫耐受的状态仍所知甚少。早期B细胞免疫耐受已知的主要机制包括受体编辑,克隆排除和克隆无反应性。其中,受体编辑是中枢免疫耐受的主要机制,特别是针对膜抗原,并且通常在20-50%的未成熟B细胞上会有受体编辑的发生。受体编辑通过上游可变区(V)基因片段和下游连接区(J)基因片段的二次重组消除了不需要的(比如具有自身反应性的)Ig基因,并因此增加了 Ig基因的V-J距离。据报道,在多种AIDs中,自身反应性Ig基因受体编辑失败促进了自身反应性抗体的产生。目的:在这项研究中,我们对ITP患者的功能性免疫组库进行了测序和功能实验研究,以期探明ITP患者中早期B细胞免疫耐受的状态及其在ITP发病中的作用,并进一步探究影响ITP患者早期免疫耐受的可能机制,为ITP的临床干预提供新的诊疗思路和可能的治疗靶点。方法:(1)招募8例根据2009国际工作组制定的实践共识初步诊断为ITP的患者,另外招募8例无自身免疫病且性别、年龄匹配的成年健康受试者作为对照,采集外周血。(2)将来自4例初诊未经治疗的ITP患者和4例健康供者的外周血10mL,通过免疫磁珠分选总B细胞,然后使用PAXgene Blood RNAKit提取分选所得总B细胞的RNA,之后再将RNA反转录为cDNA,使用复合PCR试剂盒进行两轮连续的PCR反应扩增免疫球蛋白的重链(IgH)和kappa链(IgK)的V(D)J基因片段,利用扩增产物构建基因文库,使用Agilent 2100生物分析仪对基因文库进行二代测序。使用VDJtools分析软件分析Ig基因的特征,包括片段使用,谱系重叠,多样性分析和谱系聚类等。通过使用VH替换足迹分析软件-I(VHRFAI)搜索Ig重链(IgH)V-D连接处的VH替换“足迹”来鉴定VH替代产物。(3)将来自另外4例初诊ITP患者和4例健康受试者的外周血,提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),使用抗 CD10,CD19,CD27 和 IgM 流式抗体染色,然后通过 FACS Aria Ⅲ BD Biosciences,San Jose,CA)流式分选仪将单个初始B细胞(CD10-CD19+CD27-IgM+)直接分选到96孔PCR板中,每孔一个细胞。所有样品立即在干冰上冷冻用于后续研究。(4)通过一步法RT-PCR和巢式PCR扩增免疫球蛋白基因,然后将目的基因的PCR产物克隆至相应的IgH,IgK或Igλ的表达载体中,对得到的重组质粒进行测序并通过IMGT/V-QUEST和VHRFAI进行分析。将来自同一细胞的成对的IgH和Igκ(/Igλ基因使用lipofectamine 2000共转染到HEK 293T 细胞中用于重组单克隆抗体(recombinant monoclonal antibodies,rmAbs)的产生和纯化。(5)提取人血小板膜蛋白包被ELISA板,以上述rmAbs作为第一抗体,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测rmAbs对于血小板的的反应性。(6)血小板免疫荧光试验对比来源于ITP患者和健康受试者的rmAbs对于血小板的反应性。(7)流式细胞术进一步验证来自1TP患者和健康受试者的rmAbs对于血小板的反应性。(8)分别以 Human GP Ⅱb/Ⅲa 糖蛋白、双链 DNA(dsDNA)、脂多糖(LPS)和胰岛素作为抗原,进行ELISA试验检测rmAbs的GP Ⅱb/Ⅲa反应性和多反应性。结果:(1)ITP患者外周B细胞克隆类型的改变:在二代测序最终分析的IgH和IgK序列之间或在来源于健康受试者和ITP患者的序列之间未发现显著差异,但是ITP患者的IgH克隆类型以及克隆多样性相较于健康受试者明显减少。(2)ITP患者免疫组库的变化:相较于健康受试者,我们发现在ITP患者中下游VK基因(VK4-1至3-20)和上游JK基因(JK1-3)的使用频率升高,并且ITP患者的VK-JK对距离明显缩短,提示ITP患者在IgK基因上的受体编辑不足。(3)我们从外周初始B细胞一共获得了 290个IgH序列,217个Ig κ序列和134个Ig λ序列。序列分析发现:ITP患者相较于健康受试者,其初始B细胞来源的IgK基因对于下游VK基因片段(VK4-1(?)3-20)和上游JK基因片段(JK1-3)的使用频率显著升高,且ITP患者的VK-JK对基因组距离也显著降低。(4)通过抗血小板ELISA检测我们发现,在健康对照者中,只有1.94%(2/103)的初始B细胞来源的rmAbs是抗血小板反应性阳性(血小板+)的,而在ITP患者初始B细胞来源的rmAbs中该比例为14.53%(17/117),这表明在ITP患者中有抗血小板初始B细胞的累积,该现象提示我们在ITP患.者中可能存在早期(中枢)B细胞免疫耐受的缺陷。(5)通过ELISA检测我们发现,ITP患者具有显著高于健康受试者的GPⅡb/Ⅲa 阳性(GP Ⅱb/Ⅲa+)和多反应性的初始B细胞频率,并且在抗血小板阳性的rmAbs与GP Ⅱb/Ⅲa+/多反应性的rmAbs之间具有明显的相互重叠。(6)我们比较了来自血小板+和血小板-的rmAbs的CDR3序列特征,发现血小板+rmAbs通常具有≥2个正电荷的IgH CDR3和≥12个AA的Igκ CDR3,这提示具有更多正电荷AAs的IgHCDR3和更长的IgκCDR3可能倾向于编码血小板+rmAbs。结论:(1)在原发性ITP患者中发现了有抗血小板初始B细胞的累积,表明ITP患者B细胞早期(中枢)免疫耐受存在缺陷。(2)ITP患者的B细胞早期(中枢)免疫耐受缺陷可能是由于免疫球蛋白基因的受体编辑不足导致。意义:我们的研究通过对来源于ITP患者和健康受试者的外周B细胞进行免疫组库二代测序,对初始B细胞免疫球蛋白进行一代测序以及一系列功能实验发现在原发性ITP患者中早期B细胞免疫耐受存在缺陷,而受体编辑不足可能是导致该缺陷的原因,这一发现使我们在一定程度上对ITP中枢免疫耐受的状态有所了解,有利于进一步完善对于ITP发病机制的认识。第二部分CARD9 SNP rs4077515与ITP易感性的关系研究研究背景:原发性免疫性血小板减少症(ITP)是血液内科临床上常见的获得性自身免疫性疾病,其特征在于血小板计数的短暂或持续减少。了解原发性ITP的病理生理学机制对于寻求更有效的临床干预非常重要。ITP的发病机制包括通过激活的网状内皮系统吞噬加速外周血小板破坏和骨髓中血小板生成受损,这与患者体内免疫耐受缺陷有关。自身免疫耐受受损导致体液免疫和细胞免疫反应异常。细胞免疫异常被认为在ITP的病理生理学中具有至关重要的作用。T细胞亚群比例失调(Th1/Th2比值升高)表明ITP是一种Th1主导的疾病。由基因多态性引起的Th1极化和炎性细胞因子异常影响ITP的临床特征和对治疗的反应性。半胱天冬酶募集结构域家族成员9(CARD9)是一种炎症相关分子,可引发炎性细胞因子级联反应。它能够介导促炎细胞因子的产生释放,从而驱动Th1和Th17反应。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)作为遗传变异最常见的形式,能够影响人类基因组构成并调节机体对某些疾病的易感性。最近发表的全基因组关联研究表明,人类基因组中CARD9的单核苷酸多态性rs4077515与几种人类自身免疫性炎性疾病的发展密切相关,包括类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA),IgA 肾病,强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)和炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)等。但是据我们所知,尚未有研究探索CARD9 rs4077515多态性与ITP之间的关系。鉴于功能失调的Th亚群在1TP的起始和进展中的作用,以及CARD9在炎性细胞因子产生和Th极化中的重要作用,我们提出假设CARD9多态性可能参与ITP的发病机制。目的:综上所述,现在已经有研究证实CARD9 rs4077515单核苷酸多态性与几种常见的自身免疫性炎性疾病之间存在关联。研究表明,该多态性在不同疾病中可分别起保护性,危险性或无意义的作用。ITP也是一种典型的自身免疫性炎性疾病。在本研究课题中,我们试图探讨中国汉族人群中CARD9 rs4077515单核苷酸多态性与原发性ITP之间是否存在关联。方法:(1)根据ITP国际工作组制定的纳入排除标准,从2007年至2016年我们连续收集了 294例就诊于齐鲁医院的未经治疗的ITP患者的外周血样本,与此同时还收集了 324例年龄匹配的健康受试者的外周血样本。除了疾病易感性之外,ITP患者被进一步根据严重性、激素敏感性和难治性众类,以探究CARD9 rs4077515单核苷酸多态性与复杂的临床数据间的关联。(2)提取纯化外周血的基因组DNA,PCR扩增CARD9基因片段,使用Sanger测序法测定目的基因位点的碱基信息。(3)Sanger测序获得了 ITP患者和健康受试者的目的基因位点的基因型信息,利用卡方检验或Fisher精确检验分析CARD9 rs4077515单核苷酸多态性与ITP易感性、严重性、激素敏感性和难治性之间的关系,对于统计学上具有显著差异的结果,进一步应用logistic回归分析检测其关联性强弱。结果:(1)对于CARD9 rs4077515单核苷酸多态性位点,在共显性模型下,携带突变基因型(AA)的个体相较于携带野生基因型(GG)的个体其ITP易感性显著降低。表明该位点的突变基因型(AA)具有保护性作用。与上述发现一致,在隐性模型下,与突变基因型AA相比,GG/AG基因型使个体对ITP的易感性增加了 6.183倍。因此,CARD9 rs4077515的GG/AG基因型极大地增加了 ITP的易感性。(2)在共显性和显性模型下,AG和AA/AG基因型相较于野生基因型GG使得ITP患者发生重型ITP的风险降低。因此,对于CARD9 rs4077515单核苷酸多态性位点而言,与G等位基因相比,A等位基因可能能够保护患者免于发生严重型ITP。(3)未检测到CARD9 rs4077515单核苷酸多态性与ITP患者的激素敏感性和难治性之间的关联性。结论:(1 在CARD9 rs4077515 SNP上,等位基因A、突变基因型AA和杂合基因型AG的存在对ITP具有保护性作用。(2)CARD9 rs4077515 SNP与ITP的激素敏感性和难治性无关。意义:我们的研究证明CARD9 rs4077515 SNP位点上的突变基因型的遗传与ITP易感性和严重性风险的下降相关,因此该SNP位点可能能够作为监测ITP发生和重型ITP发生的预测因子。