芍药种胚再生体系的建立

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芍药(Paeonia lactiflora Pall.)为芍药科芍药属中栽培历史最悠久的多年生草本花卉,花姿绰约,色彩丰富,应用价值广泛,历年来深受人们喜爱。当今国内外市场对芍药的需求日益增长,然而目前完整的芍药再生体系并未实现,难以进行工厂化生产。因此,如何成功对芍药优良品种进行扩繁,实现规模化生产已经成为需要解决的首要问题。本研究以芍药种胚为试验材料,对种胚启动培养、丛生芽的诱导及增殖、胚苗生根、愈伤组织诱导及再分化、胚性愈伤组织的最佳激素组合及培养方式进行筛选,解决丛生芽诱导率低、生根困难、愈伤组织再分化困难、胚性愈伤组织难以诱导等问题,建立了芍药种胚丛生芽再生体系、确定了种胚最佳启动培养方式、愈伤组织最佳培养方式、胚性愈伤组织的最佳外植体及激素,为规模化生产奠定基础。主要结论如下:1.种胚最佳消毒处理方式为75%酒精消毒30 s后,以0.1%Hg Cl2消毒5~8 min;适宜种胚萌发的最佳胚龄为授粉后75~95 d;最佳培养方式是将种胚接种在启动培养基MS+0.5 mg·L-1GA3+1.0 mg·L-16-BA,暗培养4 d后,置于正常的光照条件下进行培养,胚苗的萌发速度和生长状态显著提升。2.两步诱导法可以使芍药种胚丛生芽的诱导率显著提高,长势健壮,减少畸形芽苗。种胚丛生芽初步诱导及二次诱导最适培养基分别为MS+1.0 mg·L-1GA3+1.0 mg·L-16-BA及MS+1.0 mg·L-1GA3+2.0 mg·L-16-BA,诱导率分别为48.33%及63.89%;丛生芽增殖最适培养基为MS+1.0 mg·L-1GA3+3.0 mg·L-16-BA+0.3 g·L-1CH+0.1 mg·L-1NAA+1.0mg·L-1PVP,丛生芽的平均增殖系数为2.29,长势健壮;子叶节丛生芽与种胚丛生芽在相同激素培养条件下长势差异较大,子叶节在初步诱导中的生长状态更好,种胚丛生芽的二次诱导效果优于子叶节丛生芽。3.芍药胚苗最佳生根培养方式为1/2MS培养基中培养20 d后,转接到1/2MS+1.0mg·L-1IBA培养基中培养35 d;1.0 mg·L-1IBA与1.0 mg·L-1IAA叠加使用可刺激不定根的发生,增加其数量,但该浓度下的胚根周围会产生愈伤组织。4.子叶为诱导愈伤组织的最佳外植体,暗培养20 d可显著提高子叶愈伤组织的诱导质量;MS+0.5 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1NAA为诱导愈伤组织最佳培养基;PVP改善褐化的效果优于AC,但只适宜改善轻度褐化;最适宜愈伤组织分化的培养基为MS+0.5 mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1PVP,分化率为10.71%,0.5mg·L-1KT+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1PVP也可诱导愈伤组织分化不定芽,分化率为5.71%。5.芍药子叶、胚轴与种胚未能通过直接途径诱导产生体细胞胚胎,但完整种胚可直接诱导产生胚性愈伤组织,且在添加1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA与1.0mg·L-16-BA+2.0 mg·L-12,4-D培养基中的状态优于添加1.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1PIC,若使用PIC需适当增加其浓度;间接途径诱导胚性愈伤组织发生时,1/2MS(Ca2+)+1.0mg·L-1TDZ+2.0 mg·L-1PIC+0.5 g·L-1CH+1.0 mg·L-1PVP更适宜普通愈伤转化为胚性愈伤组织,该浓度下淡黄色凸起颗粒数量大,胚性愈伤组织诱导率高达46.67%。
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