论文部分内容阅读
目的研究小鼠眼内Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg细胞)的形成机理以及其上游信号开关c-Rel调控小鼠眼内Treg细胞形成的机制,进一步揭示Treg细胞参与眼免疫赦免的发生机理。方法(一)、眼微环境诱导Treg细胞形成的研究1)体外实验分析Treg细胞是否可以被房水诱导形成：应用野生型(WT)B6小鼠眼房水(3.0×),用于体外培养naive CD4+细胞,同时应用不同浓度TGFβ-1 (0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、4ng/ml、20ng/ml、100ng/ml TGFβ-1)体外培养naive CD4+细胞,Foxp3、CD4、CD25三重染色后,流式细胞仪分析以上各组Treg细胞的百分率,分析以上各组Foxp3平均荧光强度(Mean fluorescence intensity, MFI)数值的区别。2)体内实验分析Treg细胞是否可以在眼内被诱导形成：应用OVA-TCR-Tg B6小鼠,眼内注射OVA,应用流式细胞仪技术检测不同时间模型眼Treg细胞占眼内CD4+细胞的百分率,并与外周血、脾脏、引流淋巴结Treg细胞百分率进行比较,分析眼微环境是否能诱导Treg细胞形成。(二)、眼内Treg细胞形成上游c-Rel信号通路的研究1)体外实验应用WTB6小鼠眼房水,分别培养c-Rel基因敲除/B6小鼠naive CD4+细胞与WTB6小鼠naive CD4+细胞,Foxp3、CD4、CD25三重染色后,流式细胞仪分析以上各组Treg细胞的百分率,观察不同组间Treg细胞形成率的区别。2)体内实验应用c-Rel基因敲除/OVA-TCR-Tg/B6小鼠,眼前房内注射OVA,模型建立后不同时间,应用流式细胞仪技术检测Treg细胞、Th17细胞占眼内CD4+细胞的百分率,并与非基因敲除鼠葡萄膜炎模型进行对比。并同时应用real-time PCR检测的Foxp3 mRNA、IL-17 mRNA表达量在c-Rel基因敲除后的变化。(三)、c-Rel信号通路与角膜移植术后免疫斥反应关系的初步研究建立异系小鼠穿透性角膜移植术(PKP)模型。Real-time RT-PCR检测排斥组与未排斥组眼内Foxp3mRNA、Th17mRNA、c-rel mRNA表达水平的变化。分析c-rel信号通路与Treg细胞、Th17细胞形成的关系。结果(一)体外实验显示3.0×房水培养组Foxp3+Treg细胞百分率为8.4%±1.2%,3.0×房水诱导Treg细胞形成的能力约等于0.5 ng/ml TGFβ-1组,但是其Foxp3+的MFI却高达70±2,超过了20ng/ml TGFβ-1组(MFI=66±3)。WT小鼠眼内含有极微量的CD4+T细胞,其中Treg细胞占CD4+T细胞百分率为5.4%±0.2%,引流淋巴结中Treg细胞百分率为8.2±1.6%。体内试验显示眼前房注射OVA后2天、4天、6天眼内Treg细胞百分率分别为：60.2%±3.5%、32.2%±2.8%、28.4%±2.2%,引流淋巴结内Treg细胞百分率分别为：5.8%±0.8%、5.1%±0.6%,3.8±0.3%。注射前后眼内Treg细胞百分率较注射前显著增长(p<0.05),注射后眼内Treg细胞百分率远高于淋巴结内Treg细胞百分率(p<0.05)。(二)体外实验显示6×房水在培养48小时后诱导形成了Treg细胞,WT组Treg细胞百分率为2.4%±0.3%,c-Rel组Treg细胞百分率为1.0%±0.2%,两组差异具有统计学意义(p<0.05)。同期空白对照组几乎不能产生Treg细胞。体内实验显示c-Rel基因敲除后眼内形成的Treg细胞,Thl7细胞均发生了下降(p<0.05)。应用real-time PCR检测的Foxp3 mRNA与IL-17mRNA在cRel基因敲除后也发生了显著的降低(p<0.01)。(三)异系PKP组排斥眼IL-17mRNA与Foxp3mRNA含量均较未排斥组明显增高,分析IL-17mRNA/Foxp3mRNA的比率,可以发现此比率在未排斥组(0.25)低于排斥组(0.57)。原位移植组IL-17mRNA/Foxp3mRNA的比率均处在较低的水平。c-RelmRNA的表达量的变化趋势与Foxp3mRNA变化趋势相同。IL-17mRNA/Foxp3mRNA的比率降低时c-RelmRNA的表达量也降低。结论眼内发生免疫应答反应时会形成较多CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞,这些Treg细胞并不单纯来自于引流淋巴结,而是在眼内特殊免疫微环境中被诱导产生；眼部微环境诱导的Treg细胞其Foxp3的免疫抑制功能较强,这很可能是眼具有免疫赦免功能的重要原因。c-Rel是调控眼内Treg细胞形成的重要的上游信号通路,参与调节眼免疫赦免。