背景:镉(Cadmium,Cd)是一种半衰期长且具有蓄积性质的重金属。虽然很多研究已经对Cd在肝、肾、睾丸、肺、大脑等器官的损伤毒理作用取得了初步的证实,但Cd对中枢神经系统损伤的详细机理尚不明确,并且母体在孕期及哺乳期Cd暴露后对子代的神经系统发育并未有相关的分子机制报道。目前针对胎儿及幼儿进行Cd暴露对其大脑发育的影响研究也只停留在流行病学上,缺乏实验室数据的支持与论证。目的:比较母代Cd暴露对雌雄子代学习认知发育的影响,考察脑源性生长因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)相关信号通路调节突触可塑性与Cd损伤神经元的关系,并通过iTRAQ蛋白组学技术筛选雌雄子代海马组织中的差异表达蛋白,以期阐明母代Cd暴露损伤子代学习认知发育的毒理分子机制,为Cd污染导致儿童学习记忆能力受损的病因和治疗提供实验室依据。方法:将SD孕鼠随机分为空白对照组(Ctrl)、低剂量(1 mg/kg,Cd1)和高剂量(5 mg/kg,Cd5)Cd暴露组,自怀孕至子代出生21日内,使用灌胃的方式对母鼠进行Cd暴露,每天一次。在子代出生后(Postnatal,PND)35及56天进行水迷宫行为学测试,检测学习及认知能力;分别在PND 21、35和56时,对子代大鼠予以麻醉处死,留取血液和大脑皮质、海马组织备测。采用原子吸收光谱法(Atomic absorption spectrometry,AAS)检测大脑皮质及海马中的Cd含量;通过透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察海马CA1区中突触结构的形态学变化;免疫荧光(IF)及免疫组化(IHC)技术检测孕酮受体(Progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1)和BDNF在海马中的表达;WB技术检测BDNF合成通路上PGRMC1-MMP 9(Matrix metallopeptidase9,基质金属酶-9)-BDNF及BDNF-Trk B(Neurotrophic receptor tyrosine kinase,酪氨酸激酶B)-p-Trk B的表达;ELISA技术检测海马组织及血清中BDNF的含量;提取孕期Cd暴露的新生鼠的星形胶质细胞,并与正常乳鼠的海马神经元进行共培养,检测PGRMC1-MMP 9-BDNF及BDNF-Trk B/p-Trk B的表达。分离孕期Cd暴露新生鼠的海马组织进行iTRAQ蛋白质组学鉴定;利用蛋白富集及其所在通路分析获得雌雄子代与正常对照组对比的差异表达蛋白;利用IF及WB技术验证差异表达蛋白在雌雄子代不同时期的表达水平;提取新生雌雄乳鼠的海马神经元,构建Cd暴露细胞模型,验证差异蛋白的表达情况,同步加入外源BDNF,考察差异表达蛋白与BDNF的上下游调控关系。结果:1.在母代孕期及哺乳期Cd暴露后,在雌雄子代的大脑皮质中都能检测到Cd(Cd5:p<0.05),而在海马组织中并未检测出Cd(<0.001 mg/kg)。2.水迷宫实验结果显示,在PND 35,雄性暴露组的逃脱潜伏期明显高于Ctrl组(Cd5:p<0.05),且在空间探索实验中穿越原平台所在象限的次数明显低于Ctrl组(p<0.05),而雌性低剂量暴露组的逃脱潜伏期明显低于Ctrl组(Cd1:p<0.01),且在空间探索实验中穿越原平台所在象限的次数明显高于Ctrl组(Cd1:p<0.05);在PND56,雄性暴露组的逃脱潜伏期仍然明显高于Ctrl组(Cd5:p<0.01),且在空间探索实验中穿越原平台所在象限的次数明显低于Ctrl组(Cd5:p<0.05),而雌性模型组的逃脱潜伏期明显低于Ctrl组(Cd1:p<0.01,Cd5:p<0.01),且在空间探索实验中穿越原平台所在象限的次数与Ctrl组相比无显著差异。3.突触形态学结果显示,在PND 21,暴露组的雄性子代CA1区活性带长度显著减少(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.01),PSD平均厚度变薄(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.01),突触间隙的宽度显著增加(Cd1:p<0.01,Cd5:p<0.01),并且此趋势一直持续至PND 35及56;而在雌性子代中,PND 21时PSD平均厚度变薄(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.01),突触间隙宽度增大(Cd5:p<0.01);在PND35时PSD厚度明显增加(Cd1:p<0.05),而高剂量暴露组突触间隙仍然增大(Cd5:p<0.05);在PND 56时PSD厚度明显增厚(Cd5:p<0.05),突触间隙无明显变化;活性带长度在该三个时期均无明显变化。4.WB技术验证蛋白水平结果显示,在三个时期中,Cd暴露的雄性子代中PGRMC1、MMP-9、BDNF、TrkB、p-TrkB均为下调趋势(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.01);而在雌性中,PND 21时PGRMC1、MMP-9、BDNF、TrkB、p-TrkB均为下调趋势(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.01),在PND 35时,Cd1组的PGRMC1、MMP-9、BDNF、Trk B、p-TrkB均为上调趋势(p<0.05),而Cd5组的5个蛋白皆无显著变化。在PND 56时,Cd暴露组的PGRMC1、MMP-9、BDNF、Trk B、p-TrkB均为上调趋势(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.05)。5.IF、IHC及海马组织的ELISA结果均与组织中的WB结果趋势完全一致。血清中的ELISA结果显示,暴露组雄性子代在三个时期,血清中BDNF的含量皆为上升趋势(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.01),而在海马组织中皆为下降趋势(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.01)。雌性暴露组中,在PND 21时血清BDNF含量呈现上升(Cd5:p<0.01),海马组织中则为含量下降(Cd5:p<0.01);在PND 35时Cd1组在血清为下降趋势(Cd1:p<0.01),而在海马组织则为上升趋势(Cd1:p<0.01);在PND 56时,与Ctrl组相比,血清中含量也是下降趋势(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.01),而海马组织中仍然是上升趋势(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.01)。6.成功从新生鼠中提取了星形胶质细胞及海马神经元,并对星形胶质细胞进行了纯化和鉴定。对两种细胞进行共培养后利用WB技术进行检测,与Ctrl组比较,结果显示暴露组雄性子代PGRMC1、MMP-9、BDNF、TrkB、p-TrkB的表达为下调趋势(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.05),而雌性子代的蛋白表达没有显示出变化趋势。7.分离新生子代海马组织作蛋白质组学鉴定,并用过蛋白富集及通路分析,比较雌雄子代中差异表达蛋白的丰度,筛选出显著差异表达蛋白磷脂酸酯酶β4(Phospholipase Cβ4,PLCβ4)。相比较Ctrl组,PLCβ4在雄性Cd1组中表达上调了6.8倍,而在雌性中为下调了0.86倍。8.WB及IF技术检测结果显示,暴露组雄性子代在三个时期中PLCβ4表达均为上调趋势(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.01),而PSD95(Postsynaptic density,突触后密度95)为表达下调趋势(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.01);暴露组雌性子代在PND 21时与雄性子代的表达趋势相似(Cd5:p<0.01),PND 35时Cd1组的PLCβ4为下调趋势(Cd1:p<0.05),PSD95为上调趋势(Cd1:p<0.05),在PND 56时PLCβ4仍然保持下调趋势(Cd5:p<0.01),PSD95为上调趋势(Cd1:p<0.05,Cd5:p<0.05)。IF的结果与WB结果相一致,并向我们提示了PLCβ4是在海马齿状回(Dentategyrus,DG)中出现显著差异表达趋势。9.成功构建海马神经元Cd暴露模型,通过外源加入BNDF,考察PLCβ4与BDNF的相互调控关系。WB检测结果显示,在雄性海马神经元中,相比Ctrl组,雄性海马神经元Cd暴露组的PLCβ4均为显著上调趋势(Cd2:p<0.01),BDNF为显著下调趋势(Cd2:p<0.01);当加入外源BDNF处理后,相比较处理前相对应组别,PLCβ4在Ctrl+BDNF(p<0.01 vs Ctrl)和Cd2+BDNF(p<0.01vs Cd2)组中都逆转为下调表达,而BDNF的表达则由于加入外源蛋白,都显示为下调趋势(p<0.05,p<0.01)。在雌性海马神经元Cd暴露后,PLCβ4和BDNF的表达没有显示出差异,在加入外源BDNF后,两者的蛋白表达仍然没有任何变化趋势。结论:(1)母代在孕期及哺乳期经过Cd暴露后,较高剂量的暴露能使Cd在子代大脑皮质中蓄积,导致海马突触结构的可塑性发生损伤,且该损伤在雄性子代中并没有得到逆转,引发青年期及成年期的学习认知能力障碍;相比在雌性子代中,幼年期的突触结构损伤并没有雄性子代明显,且该损伤随着雌性子代的发育逐渐修复,并在成年期时损伤得到逆转,突触结构可塑性得到修复,因此并没有出现学习认知能力障碍。(2)Cd通过影响雌雄子代BDNF的合成及BDNF-Trk B信号通路介导突触可塑性的损伤,从而影响突触的正常生物功能。(3)通过对新生子代海马组织的蛋白质组学数据分析,发现PLCβ4在雄性Cd1组中上升了6.8倍,并参与调控多个与神经突触结构及功能相关的信号通路。分别在动物和细胞Cd暴露模型中验证PLCβ4的表达趋势,在雄性动物中呈现高表达,而在雌性动物中伴随着生长发育PLCβ4的表达趋势逐渐下调。在Cd暴露的大鼠海马神经元中加入外源BDNF,表明BDNF与PLCβ4存在相互调控关系。