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肠出血性大肠杆菌（EHEC）是产VT毒素大肠杆菌（VTEC）的一个亚群。O157:H7血清型是EHEC中典型的致病菌株,是大规模O157感染爆发的主要病原菌。O157:H7是一种食源性致病菌,牛是其首要的天然寄主,主要是食物被牛粪污染,导致感染爆发。EHEC感染会引起轻度腹泻到出血性肠炎、严重者会引起出血性尿毒综合症,甚至死亡。EHEC最关键的两个致病因子是由噬菌体编码的VT毒素和介导粘附作用的LEE毒力岛（肠道上皮细胞损伤位点）。LEE毒力岛编码的蛋白负责形成粘附抹平损伤,其典型特征是通过病原菌和寄主肠道表面的紧密粘附,在寄主细胞表面细菌粘附位点肌动蛋白富集,形成杯状基座和细胞表面边缘刷状微绒毛损伤。LEE毒力岛由LEE1到LEE5主要5个操纵子组成,编码的Ⅲ型分泌系统涉及到移位因子的分泌、效应蛋白和外膜表面紧密粘附素Intinmin与其受体蛋白Tir（由细菌编码转运到宿主细胞上的粘附素受体）。粘附素Intinmin除了和其主要受体蛋白Tir结合之外,还会和寄主细胞表面的粘附素受体（HIR）结合,如Intinmin与肠道细胞表面的β1整合素（β1-integrin）和核仁素（nucleolin）结合。有研究认为在形成稳定的intimin-Tir结构之前,粘附素intimin首先和寄主细胞的粘附素受体HIRs结合,使得细菌和寄主细胞足够接近从而完成Tir和其他效应因子从细菌到寄主上皮细胞表面的注射转运过程。EHEC O157:H7产生的VT毒素是其重要的致病因素之一,本研究关注肠出血性大肠杆菌EHEC86-24感染猪空肠细胞系（IPEC-J2）、人结肠细胞系（CaCo-2）和人喉癌细胞系（HEp-2）过程中,产生的VT毒素对其粘附定植过程的影响,以及在细菌感染IPEC-J2细胞过程中,VT毒素对其相关致病因子的基因表达水平影响,包括对致病粘附因子β1整合素（β1-integrin）和核仁素（ nucleolin）的基因表达影响,对VT毒素受体Gb3合成表达的影响,从而深入分析VT毒素在EHEC致病过程中的作用机理。试验利用λ-Red同源重组技术构建了vt2基因敲除突变菌株86-24-vt2S,同时产生了编码VT2毒素的噬菌体缺失突变菌株86-24△933W、以及突变菌株的vt2基因补充菌株86-24-vt2S（pVT2）和86-24-933W（pVT2）。将野生型菌株EHEC 86-24和不同vt2基因突变菌株与真核细胞系进行粘附试验,并对感染过程真核细胞IPEC-J2的相关粘附因子基因进行实时定量PCR检测。试验结果显示:与其亲本野生型EHEC菌株和vt2基因补充菌株比较,vt2基因敲除突变株对3株真核细胞系的粘附能力均显著降低;野生型EHEC菌株在感染IPEC-J2细胞系过程中,伴随宿主细胞相关粘附因子β1-integrin、nucleolin和Gb3合成基因的表达增加;IPEC-J2细胞系与野生型EHEC O157:H7或vt2基因补充突变株相互作用时,β1整合素的表达水平高于IPEC-J2与vt2基因敲除突变菌株或无细菌粘附时的表达水平;IPEC-J2与vt2基因敲除突变菌株粘附感染时,核仁素的表达水平降低,但是其基因补充菌株没有修复核仁素的表达到野生型水平。试验数据揭示VT2毒素在EHEC O157:H7致病菌对肠道上皮细胞的粘附过程中有促进作用,这种促进作用从基因水平上是通过提高宿主细胞表面受体因子β1-integrin和nucleolin的表达水平,从而提高了细菌的粘附功能。核仁素（Nucleolin）是一种可以表达在多种类型真核细胞表面的多功能核蛋白,作为一些病毒和粘附素的受体。核仁素是与广泛的细胞和细胞之间相互作用相关的一个受体大家族。肠致病性大肠杆菌杆（EPEC）的粘附素与β1整合素特异结合。在猪和牛的组织感染试验中,免疫染色发现β1整合素聚集在细菌粘附位点,说明整合素在EHEC字O157:H7感染过程中是一个潜在的受体蛋白。VT毒素是一种典型的AB5结构蛋白,能抑制真核细胞蛋白合成。VT毒素在EHEC感染过程中导致出血性肠炎（HC）、溶血性尿毒综合症（HUS）等严重的临床症状。VT毒素的B亚基和目标细胞表面的糖脂类受体（Gb3）结合,通过受体介导毒素内化。最近研究报道VT2毒素通过刺激真核细胞表达核仁素,从而促进EHEC在肠道上的定植过程。然而,关于VT毒素促进细菌粘附定植的理论依然具有争议。本实验室前期研究工作中构建了萘啶酮酸抗性EHEC菌株的vt2基因插入突变菌株,实验结果显示vt2基因突变导致EHEC 86-24对IPEC-J2和HEp-2的粘附能力降低。本研究中重新在萘啶酮酸敏感的野生型EHEC 86-24菌株基础上,产生了vt2基因敲除突变菌株和编码VT2噬菌体缺失突变菌株,评估了两株EHEC O157:H7突变菌株对IPEC-J2细胞系的粘附特征,并和细胞系HEp-2和CaCo-2进行了比较。实验室前期用小猪做了动物肠道感染体内实验,在此基础上本研究建立新的猪结肠IPEC-J2细胞体外感染模型,研究了EHEC O157:H7 86-24及其等位基因vt2-突变菌株对IPEC-J2细胞的粘附受体nucleolin、β1-intergrin和Gb3合成的表达影响,为进一步准确分析EHEC O157:H7的感染机理提供理论依据。